Author Produced

التسليم داخل الشرايين للخلايا الجذعية العصبية إلى الدماغ الفئران والفأر: تطبيق على الإقفاري الدماغي

JoVE Journal
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

طريقة لتوصيل الخلايا الجذعية العصبية، قابلة للتكيف مع حلول الحقن أو التعليقات، من خلال الشريان السباتي المشترك (الماوس) أو الشريان السباتي الخارجي (الجرذ) بعد السكتة الدماغية الإقفارية. يتم توزيع الخلايا عن طريق الحقن على نطاق واسع في جميع أنحاء الدماغ parenchyma ويمكن الكشف عنها تصل إلى 30 د بعد الولادة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, B., Joseph, B., Saatman, K. E., Chen, L. Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (160), e61119, doi:10.3791/61119 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

العلاج بالخلايا الجذعية العصبية (NSC) هو علاج مبتكر ناشئ للسكتة الدماغية وإصابات الدماغ الرضية والاضطرابات العصبية. بالمقارنة مع الولادة داخل الجمجمة، فإن الإدارة داخل الشرايين للNSCs أقل توغلاً وتنتج توزيعاً أكثر انتشاراً للـ NSCs داخل الدماغ. وعلاوة على ذلك، يسمح التسليم داخل الشرايين تأثير المرور الأول في الدورة الدموية في الدماغ، مما يقلل من احتمال محاصرة الخلايا في الأجهزة الطرفية، مثل الكبد والطحال، وهي مضاعفات مرتبطة بالحقن المحيطي. هنا، نحن بالتفصيل منهجية، في كل من الفئران والجرذان، لتسليم NSCs من خلال الشريان السباتي المشترك (الماوس) أو الشريان السباتي الخارجي (الفئران) إلى نصف الكرة الأرضية أقل من المتوسط بعد السكتة الدماغية. باستخدام NSCs المسمى GFP ، نوضح التوزيع الواسع النطاق الذي تحقق في جميع أنحاء نصف الكرة الأرضية الإب وسائل القوارض في 1 d و 1 أسبوع و 4 أسابيع بعد الولادة بعد الإشهار ، مع كثافة أعلى في موقع إصابة الإقفاري أو بالقرب منه. بالإضافة إلى البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل، نعرض أدلة على تمايز الخلايا التي تحمل علامة GFP في 4 أسابيع. ويمكن أيضاً استخدام نهج التسليم داخل الشرايين الموصوف هنا بالنسبة للـ NSCs في إدارة المركبات العلاجية، وبالتالي قابليته للتطبيق الواسع على نماذج الإصابات والأمراض المتنوعة في الجهاز العصبي المركزي عبر أنواع متعددة.

Introduction

العلاج بالخلايا الجذعية (SC) يحمل إمكانات هائلة كعلاج للأمراض العصبية، بما في ذلك السكتة الدماغية، صدمة الرأس والخرف1،2،3،4،5،6. ومع ذلك ، فإن طريقة فعالة لتقديم SCs الخارجية إلى الدماغ المريض لا تزال إشكالية2،6،7،8،99،10،11،12،13. SCs تسليمها من خلال طرق التسليم الطرفية، بما في ذلك الحقن الوريدي (IV) أو داخل الصفاق (IP)، تخضع لتصفية أول تمريرة في دوران الأوعية الدقيقة، وخاصة في الرئة والكبد والطحال والعضلات,,13،,14،وزيادة فرص تراكم الخلايا في المناطق غير المستهدفة. طريقة الحقن داخل المخية الغازية ينتج في الأنسجة المخية المترجمة الضرر وتوزيع مقيد جدا من SCs بالقرب من موقع الحقن2,6,8,14,15,16. لقد أنشأنا مؤخرًا طريقة حقن داخل الشرايين تعتمد على القسطرة لتقديم SCs العصبية الخارجية (NSCs) ، والتي يتم وصفها هنا في نموذج القوارض من السكتة الدماغية الدماغية المحورية. نحن نحفز عابرة (1 ح) إصابة نقص التروية reperfusion في نصف الكرة الأرضية واحد باستخدام خيوط مطاط سيليكون المغلفة لocclude الشريان الدماغي الأوسط الأيسر (MCA) في الفأر أو الفئران17،18،19. في هذا النموذج لاحظنا أن ما يقرب من 75-85٪ اكتئاب تدفق الدم الدماغي (CBF) في نصف الكرة الأرضية ipsilateral مع دوبلر الليزر أو الليزر التصوير البقع17،19، مما يؤدي إلى عجز عصبي ثابت17،18،19.

لأغراض توفير الوقت، يتم تعيين الفيديو للعب بمعدل ضعف السرعة العادية والإجراءات الجراحية الروتينية مثل إعداد الجلد وإغلاق الجرح مع خياطة واستخدام وإعداد مضخة حقنة الآلية لا تقدم. ويتضح طريقة التسليم داخل الشرايين من NSCs في سياق نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) من السكتة الدماغية التجريبية في القوارض. لذلك، نحن نشمل إجراء السكتة الدماغية الإقفارية العابرة من أجل إظهار كيفية إجراء الجراحة الثانية، الحقن داخل الشرايين، باستخدام الموقع الجراحي السابق على نفس الحيوان. 10- ويتضح جدوى الولادة داخل الشرايين من مراكز الأمومة الوطنية في نماذج السكتة الدماغية القوارض من خلال تقييم توزيع والبقاء في المراكز غير المتخصصة الخارجية. سيتم الإبلاغ عن فعالية العلاج NSC لتكين أمراض الدماغ والخلل العصبي بشكل منفصل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل لجنة العناية الحيوانية المؤسسية (IACUC) في جامعة كنتاكي ، وتم اتخاذ العناية المناسبة لتقليل الإجهاد أو الألم المرتبط بالجراحة.

1. إعداد قسطرة الحقن والسنانير الجراحية

  1. بناء قسطرة الحقن (الشكل 1). جمع المواد الضرورية بما في ذلك: MRE010، MRE025، والأنابيب MRE050، 20 G، 26 G و 27 G حقن الإبر(الشكل 2A)،600 حصى الصنفرة، superglue واثنين من مكونات 5 دقائق الايبوكسي.
    1. قطع 20 G و 26 G الإبر في 1 سم من محور إبرة وتلميع نهاية على الصنفرة (الشكل 2B). تدفق الإبر مع 10 مل من الماء المقطر مزدوجة لتنظيف إبرة تتحمل.
      ملاحظة: يتم استخدام تصميمين مختلفين(الشكل 1). تصميم 1 لديه موصل واحد ويستخدم لحقن من الحلول أو تعليق. تصميم 2 لديه 20 G و 26 G Luer قفل الموصلات لحقن الخلايا (20 غ إبرة) وتدفق من حجم القتلى (26 غ إبرة) لضمان تسليم كامل حجم الحل المحتوية على NSC.
  2. تصميم 1: إدراج 3-4 سم طول MRE010 القسطرة في قسطرة 15 سم طول MRE025 وآمنة مع superglue.
    1. قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب MRE025 بشريحة من قسطرة MRE050، وآمن مع الغلية الفائقة. إدراج إبرة 20 ز مملة في نهاية المتبقية من القسطرة MRE050 وآمنة مع superglue(الشكل 1).
    2. تعزيز مواقع الاتصال مع الغراء الايبوكسي. هذا تصميم القسطرة هو الأمثل لحقن الكواشف (مثل الكيماويات أو الأدوية أو حلول بيولوجية أخرى مثل السيتوكينات).
  3. تصميم 2: إدراج 3-4 سم طول MRE010 القسطرة في قسطرة 15 سم طول MRE025 وآمنة مع superglue.
    1. قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب MRE025 بشريحة من قسطرة MRE050، وآمن مع الغلية الفائقة. أدخل إبرة 20 G المملة في الطرف المتبقي من القسطرة MRE050 وآمن مع superglue.
    2. إدراج إبرة 26 G مملة في أنبوب MRE050 بالقرب من طرف الإبرة الأولى، بعد اتجاه تدفق الحقن، وآمنة مع superglue(الشكل 1 والشكل 2C). تعزيز كل من الإبر والجزء من أنبوب MRE050 مع الايبوكسي واضحة (الشكل 2C). يسمح هذا التصميم بحقن حل السيارة من خلال إبرة 2 (26 G) بعد حقن NSC من خلال إبرة 1 (20 جم) لطرد حجم الميت في القسطرة في الدورة الدموية في الدماغ، وتحقيق تحكم أكثر دقة في أحجام الحقن.
    3. استخدم إبرة 20 G لحقن NSC من أجل تقليل الضرر الذي يلحق بـ NSCs ، والذي يمكن أن يؤثر سلبًا على الجدوى.
  4. بعد البناء، قم بتدفّق القسطرة بـ 10 مل من الماء المقطر المزدوج، متبوعاً بنسبة 70% من الإيثانول، ثم نقعها في 70% من الإيثانول بين عشية وضحاها.
  5. قبل الجراحة، وإزالة القسطرة من 70٪ الإيثانول وتدفق مع 10 مل من برنامج تلفزيوني معقمة، ووضعها في علبة أداة جراحية autoclaved للتخزين والنقل.
  6. إعداد السنانير الجراحية
    1. قطع رمح إبرة 1.5- 2 سم طويلة من إبرة 27 G، وتلميع كلا طرفي على الصنفرة حتى مملة. ثم استخدام المشبك hemostatic صغيرة لثني رمح في خطاف في نهاية واحدة وعلى شكل حلقة في الطرف الآخر.
    2. أدخل 10-15 سم طويلة MRE025 من خلال حلقة وآمنة مع الشريط الجراحي واضحة (الشكل 2D). جعل 2 أكثر السنانير باستخدام نفس الأسلوب.
    3. انقع جميع السنانير وأنظمة القسطرة في 70٪ من الإيثانول حتى الاستخدام.

2. إعداد الحيوان: التسليم، والإسكان، والتكيف مع البيئة

  1. ذكور والإناث C57BL/6 الفئران (10-12 أسابيع، ن = 10/نقطة الوقت) والجرذان Wistar (10-12 أسابيع، ن = 10) استخدمت في هذه الدراسة.
  2. منزل لهم في vivarium الحيوان التي تسيطر عليها البيئة مع الغذاء والماء الإعلانية libitum.
  3. السماح لهم بالتكيف مع البيئة قبل أسبوع واحد على الأقل من جراحة السكتة الدماغية.
    ملاحظة: مات فأر واحد وجرذ واحد في 1 د بعد جراحة السكتة الدماغية وقتل فأر واحد في 3 د بعد السكتة الدماغية قبل حقن NSC لأسباب إنسانية بسبب الشلل الشديد.

3. ثقافة الماوس والخلايا الجذعية العصبية الفئران (NSCs)

ملاحظة: تم عزل NSCs وتنميتها بعد بروتوكول20.

  1. الماوس
    1. عزل النمط البري (WT) وGFP المسمى NSCs من القشرة الجنينية E18 من الفئران الإناث C57BL/6 الحوامل في الوقت المناسب التي تتزاوج مع الفئران الذكور إيجابية GFP (B6 ACTb-EGFP). لتحديد الأجنة GFP (+)، لاحظ الأجنة التي تم حصادها على مجهر الفلوروس باستخدام قناة FITC. GFP (+) الأجنة تعطي إشارة الفلورنس الأخضر في حين أن الأجنة WT تظهر فقط ضعف فلورا لصناعة السيارات(الشكل 3A).
  2. الفئران
    1. عزل NSCs من المنطقة دون البطينية (SVZ) من الفئران WT الشباب البالغين. تسمية لهم مع DiI فقط قبل الحقن بعد تعليمات الشركة المصنعة21.
  3. الماوس أو الفئران NSCs الجرذان حتى تتطور إلى neurospheres، ومرور عليها عندما يصل قطر الكرة إلى حوالي 100 ميكرومتر(الشكل 3B). استخدام NSCs للحقن بين المقاطع 3 و 5.
  4. التحقق من خصائص الخلايا الجذعية باستخدام لوحة علامة الخلايا الجذعية الجنينية (الشكل 3C).
  5. في يوم الحقن، وجمع المجالات NSC وتفكك مع حل مفرزة الخلية، وتعليق في برنامج تلفزيوني خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم إلى تركيز 107 خلايا / مل، ووضع على الجليد الرطب حتى الحقن.

4. التحضير الجراحي

  1. قبل الجراحة، ضع علامة على نقطة على خياطة MCAO التجارية مع قلم علامة الفضة عند 9 مم (للفأرة) أو 15 مم (للجرذ) من طرف مرجع الجراحة لطول الإدراج. أوتوكلاف الأدوات الجراحية (مقص، ملقط) والأدوات قبل كل عملية جراحية، والحرارة تعقيم لهم في معقمة حبة الزجاج بين العمليات.
  2. حث التخدير في الحيوانات مع 5٪ isoflurane عن طريق الاستنشاق والحفاظ على التخدير مع 1-2٪ isoflurane. تقييم عمق التخدير من خلال مراقبة الظروف العامة (نمط التنفس، وحركة الخفقان، وموقف تصحيح الجسم العفوي)، ومنعكس القرنية والاستجابة لقرصة إصبع القدم.
  3. وضع supine الحيوان على وسادة التدفئة، وإعداد موقع العمليات الجراحية على الحيوان عن طريق قص وتنقية مع حل بيتادين تليها 70٪ الإيثانول. حماية عيون الحيوان من التجفيف عن طريق تطبيق مرهم العيون (على سبيل المثال، مرهم المسيل للدموع الاصطناعي) أثناء الجراحة.
  4. واعمل الجراحين على فرك أيديهم بدقة باستخدام فرك الإبادة الجرثومية وارتداء قناع وقفازات معقمة ومعطف مختبر نظيف.

5. الشريان الدماغي الأوسط انسداد (MCAO) جراحة السكتة الدماغية

ملاحظة: العمليات الجراحية للحث على السكتة الدماغية الإقفارية في نصف الكرة الأرضية واحد من الفأر أو الفئران متشابهة في أن يتم إدخال خياطة في الشريان السباتي الداخلي (ICA) لocclude تدفق الدم(الشكل 4)17,18,19,22. ومع ذلك، يختلف الشريان المحدد لإدراج الغرزة استنادًا إلى مساحة التشغيل المتوفرة المطلوبة لحقن الخلايا الجذعية اللاحقة. الجرذ لديه مساحة واسعة في الجزء الخارجي الشريان السباتي (ECA) للسماح اثنين من منفصلة، والعمليات الجراحية تسلسلي (السكتة الدماغية وحقن NSC)، ولكن الماوس لا، تتطلب نهجا بديلا. السكتة الدماغية الناجمة عن تغيرات تدفق الدم, وقد تم الإبلاغ عن حجم المخ فيلكت والعجز العصبي كما هو الحال في التقارير السابقة للمؤلفين17,18,19.

  1. للحث على السكتة الدماغية الإقفارية، تبدأ كل من الفئران والفأر العمليات الجراحية مع شق منتصف الخط على منطقة عنق الرحم، وعزل الشريان السباتي المشترك الأيسر (CCA)، اللجنة الاقتصادية لأفريقيا وICA(الشكل 4). توخي الحذر لعدم تمديد, إزاحة أو الضغط على العصب CCA أو المبهمة. منذ اختيار الشرايين والخطوات الجراحية تختلف بعد ذلك، سيتم وصف جراحة MCAO على الماوس والجرذ بشكل منفصل.
  2. MCAO جراحة على الماوس (الشكل 4A)
    1. مكان ثلاثة مضفر 6-0 خياطة النايلون تحت CCA (الشكل 4A، الخطوة 1) ، وجعل عقدة واحدة جراحية ضيقة لocclude السفينة بعيدا عن التشعب ممكن باستخدام سلسلة قريبة (الشكل 4A، الخطوة 2). تقليم أسفل ينتهي الغرز.
    2. جعل slipknot في الجانب القاصي من CCA (تحذير: لا الإفراط في تشديد كما سيتم الافراج عنه في الخطوة 6) وزلقة واحدة فضفاضة في ما بين عقدتين تشديد(الشكل 4A، الخطوة 2).
    3. قطع شق صغير (~ 1/4 - 1/3 من محيط) على مقربة من عقدة قريبة على CCA مع microscissors (الشكل 4A, الخطوة 3), وإدراج بعناية المطاط سيليكون التجارية المغلفة 7-0 خياطة النايلون الصلبة (الشكل 4A, الخطوة 4). تأمين هذه الغرزة مع سلسلة الأوسط، وتشديد بما فيه الكفاية(الشكل 4A،الخطوة 5) لضمان عدم تسرب الدم من شق وحركة من السيليكون المطاط المغلفة خيوط النايلون من قبل تدفق الظهر من ICA، في حين لا تزال تسمح للنهوض من خياطة نحو اللجنة الاقتصادية لأفريقيا مع دفع لطيف من قبل ملاقط.
    4. حرر الشريحة العليا (الوصاف)(الشكل 4A، الخطوة 6) وتقدم خياطة النايلون إلى ICA حتى يمر طرفها بالتشعب لـ 9 مم (باستخدام علامة الفضة على الغرز كمرجع). تشديد زلقة اثنين العلوي لتأمين خياطة ومنع تدفق الدم.
    5. سحب خيوط 1 ح في وقت لاحق(الشكل 4A, الخطوة 7) وligate CCA باستخدام عقدة الأوسط لمنع النزيف (الشكل 4A, الخطوات 5-7 في ترتيب عكسي, النتائج النهائية كما رأينا في الخطوة 8). أطلق العقدة العليا. أغلق الجرح بخياطة جراحية 4-0.
  3. MCAO جراحة على الفئران (الشكل 4B)
    1. مكان اثنين مضفر 6-0 خياطة النايلون تحت ECA (الشكل 4B، الخطوة 1) ، وجعل عقدة واحدة ضيقة في نهاية القاصي قدر الإمكان(الشكل 4B، الخطوة 2).
    2. ضع مقاطع السفينة على ICA وCCA لانسداد تدفق الدم الشرياني(الشكل 4B، الخطوة 3). يمكن استخدام زلكنوت كبديل لمقطع السفينة.
    3. جعل شق صغير على ايكا مع microscisors(الشكل 4B، والخطوات 3-4) ، إدراج المطاط سيليكون المغلفة التجارية 6-0 خيوط النايلون(الشكل 4B، الخطوة 5) ، وتأمين بشكل صحيح مع زلقة على اللجنة الاقتصادية لأفريقيا.
    4. إطلاق مقطع السفينة على ICA، تقدم خيوط في ICA حتى علامة الفضة (15 مم) تصل إلى تشعب(الشكل 4B،الخطوة 6)، ومن ثم تأمين خياطة مع عقدة2nd على رابطة ابكتا (الشكل 4B، الخطوة 6).
    5. بعد 1 ح من الإقفاري، وسحب هذا الخيط وligate شق لمنع النزيف(الشكل 4B, الخطوة 7), إزالة مقطع السفينة من CCA (النتيجة النهائية كما في الخطوة 8), وإغلاق الجرح مع خياطة جراحية 4-0.

6- التعافي

  1. بعد جراحة السكتة الدماغية، ضع الحيوانات على وسادة التدفئة حتى يستعيد وعيه بالكامل.
  2. توفير المسكن عن طريق الحقن تحت الجلد. إعادة الحيوانات إلى أقفاص منازلهم مع الحصول على الماء والغذاء الإعلانية libitum.

7. الحقن داخل الشرايين

  1. اغسل القسطرة بالكامل بنسبة 70% من الإيثانول واغمسها بين عشية وضحاها حتى الاستخدام. الحق قبل الحقن، وربط قفل لور من الإبرة مع حقنة معقمة، وغسل الجانب كامل تجويف من نظام القسطرة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني عقيمة.
  2. نافذة الوقت والتحضير لحقن NSC
    ملاحظة: استناداً إلى الخبرة والتقارير الواردة من فرق البحث الأخرى، فإن توقيت الحقن في NSC أمر بالغ الأهمية لبقاء كل من الأشخاص وNSCs الخارجية. في دراستنا التجريبية، حقن NSCs في وقت مبكر من النقاط (داخل أول 6 ح بعد إعادة ضخ) أدى إلى ارتفاع معدل الوفيات. وهكذا، اختبرنا في وقت لاحق حقن نقاط الوقت وتحديد الإطار الزمني بين 2 د (48 ح) إلى 3 د (72 ساعة) بعد السكتة الدماغية آمنة ومقبولة للحيوانات، وكفاءة في تحقيق التوزيع داخل 1000 NSCs. النتائج المقدمة هنا هي من الحيوانات تلقى حقن NSC في 3 د بعد الإصابة.
    1. تعيين حقن حقنة مضخة معدل في 20 ميكرولتر / دقيقة للفئران و 50 ميكرولتر / دقيقة للفئران. يمكن أن تؤدي السرعة المفرطة أو مدة الحقن إلى زيادة حجم الجهازية ، والتي تكون الفئران أكثر عرضة لها من الفئران.
    2. باختصار ، في 3 د بعد جراحة السكتة الدماغية ، تخدير الحيوانات مع isoflurane ووضعها على وسادة التدفئة.
    3. إعادة فتح الجرح عنق الرحم وفضح اللجنة الاقتصادية لأفريقيا، ICA وCCA مرة أخرى(الشكل 5،الخطوة 1). كما هو الحال في جراحات السكتة الدماغية، وتحديد مسار الحقن على أساس الأنواع. استخدام CCA لحقن NSC في الماوس، و 33 ا.ا.
  3. الحقن داخل الشرايين من خلال CCA في الماوس
    1. مكان اثنين 6-0 خياطة النايلون مضفر تحت CCA. إنشاء slipknot فضفاضة مع كل واحد منهم بين التشعب وعقدة أقل من جراحة السكتة الدماغية السابقة(الشكل 5, الخطوة 2).
    2. تشديد slipknot العلوي ومن ثم جعل شق صغير فوق عقدة أقل (الشكل 5، الخطوة 3). إدراج قسطرة MRE010 من خلال شق (الشكل 5, الخطوة 4) وآمن مع عقدة الأوسط دون عرقلة تدفق الحقن (الشكل 5, الخطوة 5). يجب أن يكون التدفق الخلفي للدم مرئيًا في القسطرة عند تحرير العقدة العلوية وضبط موضع القسطرة.
    3. ضع مقطع سفينة على 1 X 106 GFP-NSCs من خلال هذا القسطرة في 20 ميكرولتر/دقيقة لمدة 5 دقائق مع مضخة حقنة، تليها تدفق مع 50-100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بالسرعة نفسها.
    4. بعد الحقن، ligate CCA فوق شق مع عقدة زلة العلوي وسحب القسطرة MRE010(الشكل 5، الخطوة 6). تشديد وتقليم عقدة الأوسط وعقدة العليا. إزالة مقطع السفينة من اللجنة الاقتصادية لأفريقيا. الرجوع إلى الصورة النهائية في الشكل 5، الخطوة 7.
    5. أغلق الجرح بخياطة جراحية 4-0.
    6. بعد توفير الانتعاش كافية على وسادة التدفئة والحقن تحت الجلد مسكن، عودة الحيوانات إلى قفص وطنهم.
  4. الحقن داخل الشرايين من خلال اللجنة الاقتصادية لأفريقيا في الفئران
    1. مؤقتاً occlude اللجنة الاقتصادية لأفريقيا وCCA مع لقطات السفينة(الشكل 5، الخطوة 2).
    2. إجراء شق صغير في الجانب القريب من اللجنة الاقتصادية لأفريقيا (الشكل 5، الخطوة 3) ، أدخل قسطرة MRE010 ، وآمن مع عقدة (الشكل 5، الخطوة 4).
    3. إزالة كل من لقطات السفينة، وحقن 5 × 106 NSCs في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 2 دقيقة، تليها تدفق مع 50-100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني(الشكل 5،الخطوة 5) في نفس السرعة، وذلك باستخدام مضخة حقنة الآلية.
    4. بعد الحقن، و occlude CCA و ECA مع لقطات السفينة مرة أخرى وligate اللجنة الاقتصادية لأفريقيا في الجانب القريب من الشق الثاني بعد سحب القسطرة الحقن(الشكل 5، الخطوة 6).
    5. إزالة اثنين من قصاصات السفينة(الشكل 5، الخطوة 7) وإغلاق الجرح مع خياطة 4-0 الجراحية.
    6. بعد توفير الانتعاش كافية على وسادة التدفئة والحقن تحت الجلد مسكن، عودة الحيوانات إلى قفص وطنهم.
  5. فحص النسيج
    1. جمع العقول من الفئران والجرذان التي تلقت السكتة الدماغية الإقفارية تليها حقن NSCs أو حل السيارة بعد القتل الرحيم وضخ داخل القلب مع 4٪ شبهformaldehyde في 1 د (الماوس والجرذ) ، 7 د (الماوس) و 30 د (الماوس) بعد الحقن. وتألفت كل مجموعة من هذه المجموعات الأربع من 5 NSC و 5 سيارات حقن الحيوانات.
    2. إصلاح العقول بين عشية وضحاها وpreopreserve في 30٪ السكروز ل3 د.
    3. تضمين العقول في أكتوبر، شريحة في 40 ميكرومتر سمك، ودراسة توزيع NSCs بعد التحمّل المناعي مع علامات محددة الخلية، بما في ذلك البروتين حمضي الرجفان الدبقية (GFAP، الخلايا الفلكية)، Tuj1 (الخلايا العصبية الناضجة)، doublecortin (DCX، الخلايا العصبية غير ناضجة).
      ملاحظة: بسبب عدم وجود سلالة الفئران التي تعبر عن GFP، استخدمنا DiI، وهي تسمية فلورية عابرة، لـ NSCs الفئران، والتي لا تسمح إلا بالملاحظة قصيرة الأجل نسبياً. وبالتالي، تم فحص توزيع NSC فقط في 1 د بعد السكتة الدماغية في الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم الكشف عن NSCs المسمى GFP بسهولة في الدماغ الإقفاري ، ومعظمها في نصف الكرة المتوسطي ، خاصة في penumbra وعلى طول حافة الإصابة(الشكل 6). الفاحص كان وحيد التعمية أثناء التصوير والتحليل.

على سبيل المثال، في 1 د بعد الحقن، تم الكشف عن NSCs داخل قرن آمون الماوس. وأظهرت مجموعة فرعية من NSCs التعبير المشترك عن علامة الخلايا العصبية غير ناضجة DCX في الجيروسكوبات دنت حتى في هذه النقطة الزمنية المبكرة(الشكل 6A).

في 10 د بعد السكتة الدماغية (7 د بعد حقن NSC)، لوحظ خارجي GFP-NSCs في أعلى كثافة عند حافة الإصابة (منطقة مستجمعات المياه) في المخطط والقشرة(الشكل 6B). ومن الجدير بالذكر أن من قبل 7 د بعد حقن العديد من GFP-NSCs أعرب أيضا DCX (التي تظهرها الدوائر الزرقاء), مشيرا إلى مصيرهم العصبي. بالمقارنة مع الحيوانات التي تلقت حقن حل السيارة، حقن NSC أيضا زيادة DCX تلطيخ (أحمر) في نصف الكرة الأرضية ipsilateral.

في 30 د بعد الحقن, تم الكشف عن NSCs لا تزال في القشرة المصابة, وأظهرت جزءا منهم التعبير عن علامة دغلية GFAP(الشكل 6C)أو علامة الخلايا العصبية ناضجة Tuj1 (الشكل 6D), مما يدل على إمكانية NSCs خارجية للتمييز في أي من الداللي أو مصير الخلايا العصبية, والبقاء على قيد الحياة تصل إلى 1 شهر في الدماغ المصاب.

Figure 1
الشكل 1: التصاميم التخطيطية من القسطرة الحقن. نقدم اثنين من التصاميم، وتصميم 1 لحقن حل مركب والتصميم 2 لحقن الخلايا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعداد القسطرة لحقن NSC وخطاطيف جراحية. (أ)مواد لبناء القسطرة: MRE010، MRE025 و MRE050 القسطرة في 3 سم، ~ 10-15 سم، وأطوال 3 سم، على التوالي. (B) قطع نصائح إبرة وتلميع حتى مملة. (C)ربط كل قطعة وآمنة مع superglue، ومن ثم تضمين كل من الإبرة luer أقفال وMER050 الجزء في الايبوكسي لتعزيز. ) جعل خطاف الجراحية باستخدام 27 ز رمح إبرة والقسطرة MRE025. شريط مقياس: 5 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: ثقافة الخلايا الجذعية العصبية (+). (أ)تحديد أجنة GFP (+) مع مجهر الفلوريسنس باستخدام قناة FITC. (ب) عزل و ثقافة NSCs القشرية حتى تشكل neurospheres. شريط مقياس: 100 μm.(C)فحص خصائص الغلاف العصبي باستخدام لوحة علامة الخلايا الجذعية. شريط مقياس: 50 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: صور تخطيطية لعملية جراحية في الدماغ الشريان الدماغي الأوسط خطوة بخطوة (MCAO) على الفئران أو الفئران. ارجع إلى الفيديو لإجراء عملية جراحية مفصلة. ICA, الشريان السباتي الداخلي; ECA, الشريان السباتي الخارجي; CCA، الشريان السباتي المشترك. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الصور التخطيطية لحقن الخلايا الجذعية العصبية داخل الشرايين (NSC) في الفأر أو الفئران. ارجع إلى الفيديو لإجراء عملية جراحية مفصلة. ICA, الشريان السباتي الداخلي; ECA, الشريان السباتي الخارجي; CCA، الشريان السباتي المشترك. يشير السهم الأخضر إلى اتجاه التدفق أثناء الحقن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: توزيع الخلايا الجذعية العصبية وبقائها وتمايزها (NSCs) في الدماغ الإقفاري. (أ)الكشف عن GFP (+) NSCs داخل الحصن الحصن في 1 د بعد الحقن. الخلايا الجذعية الفلورية الخضراء; ضعف الكوستين (DCX) مناعية تظهر باللون الأحمر. يشير السهم الأبيض إلى GFP (+) NSC مع تعبير DCX. (B)خريطة تخطيطية من GFP (+) الخلايا وDCX labelled الخلايا في 10 د بعد Ischemia-Reperfusion (I-R) في عناصر تحكم صورية (لا حقن) والمركبة (I-R) أو NSC (I-R + NSC) حقن الفئران. تُصوَّر تضاريس الإهانة الإقفاريّة في التخطيطي الأخير، حيث يمثّل اللون البرتقالي الأخف وزناً والمظلم المنطقة الخاضعة للتحدي الإقفاري واللب النخري، على التوالي. يشير الشريط الأزرق إلى منطقة "مستجمعات المياه". المستطيلات الرمادية تصور المواقع التي تم التقاط الصور فيها (C)و (D). (C, D) يمكن أن تفرق NSCs الخارجية إلى مصير سجلي (GFAP، C) أو مصير الخلايا العصبية (Tuj1، D) بنسبة 30 د بعد الولادة. لم تلاحظ أي إشارات هامة في قناة FITC (GFP) في الحيوانات السكتة الدماغية التي تلقت حقن السيارة (السيارة في C و D)، بينما في NSC حقن الفئران، تم تصور GFP-NSCs على قيد الحياة وcalcalized مع GFAP (C) أو Tuj1 (D) تلطيخ. تشير الأسهم إلى تراكب قناتين. شريط مقياس: 20 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ولا يزال العلاج بالخلايا الجذعية للأمراض العصبية في مرحلة استكشافية مبكرة. وتتمثل إحدى القضايا الرئيسية في عدم وجود طريقة راسخة لإيصال الـ SCs أو NSCs إلى الدماغ.

على الرغم من أنه يمكن اكتشاف SCs/NSCs الخارجية في الدماغ بعد الحقن الوريدي (IV) أو داخل الصفاق (IP) أو الحقن داخل البارفينتشمي/داخل الجمجمة، فإن لكل نهج تسليم عيوب. ويقدر أن السكان يمكن الكشف عنها داخل الدماغ تكون منخفضة جدا مع حقن المحيطية (IV أو IP), تمثل سوى جزء صغير من الخلايا حقن أو غرست. الحقن داخل المخاتير تعطي توزيعاً بؤري جداً، وقد تستحث مباشرة إصابة الدماغ,,,,,10،,11،,12،,13. لذلك، اختبرنا جدوى الحقن داخل الشرايين كوسيلة بديلة لتسليم NSC بعد السكتة الدماغية. هذا الأسلوب يسلم NSCs من خلال القذف الدماغي ipsilateral بعد اهانة السكتة الدماغية. إذا تم حقنه في وقت مبكر بعد السكتة الدماغية، يمكن أن يعبر NSCs الخارجية حاجز الدم في الدماغ المعطل (BBB)، وتحقيق توزيع واسع في جميع أنحاء الدماغ. ميزة واحدة للحقن داخل الشرايين هو أنه يستخدم تأثير مرور أول داخل الجهاز العصبي المركزي، وتعظيم إمكانية NSCs الخارجية لتسوية في الدماغ، على النقيض من طرق التسليم الطرفية التي تمر الخلايا أولا من خلال دوران غنية من أجهزة الترشيح مثل الرئة والكبد.

النهج داخل الشرايين الموصوفة هنا هو تنوعا، ويمكن تكييفها لاستيعاب أنواع مختلفة من نماذج التسليم والإصابات أو نماذج المرض. على الرغم من أن في الدراسة الحالية يتم تنفيذ حقن واحد فقط داخل الشرايين، يمكن ربط القسطرة MRE025 إلى منفذ صغير مضمن تحت الجلد، من خلالها يمكن أن تتلقى الحيوانات الحقن المتكررة داخل الشرايين12. وعلاوة على ذلك، مع أبسط، تصميم واحد التجويف، ويمكن استخدام هذه الطريقة الحقن لتسليم الكواشف في الحل12،23. إذا كان هناك حاجة إلى تقديم علاجات متعددة ، يمكن استخدام تصميم التجويف المزدوج لتقديم حل أولي في وقت واحد أو بالتتابع مع دواء أو مركب ثان. بالنسبة للتطبيقات على نماذج القوارض من التنكس العصبي أو إصابة الدماغ الرضية ، حيث لا توجد حاجة لجراحة السكتة الدماغية الأولى ، يمكن إجراء جراحة لتركيب القسطرة في الحقن في الماوس على اللجنة الاقتصادية لأفريقيا (نفس البروتوكول كما هو الحال بالنسبة للجرذ ، وتعديل حجم الحقن ومعدل في الخطوة 7.4 للفئران) بشكل مناسب ) ، لتجنب الاضطرابات المحتملة لتدفق الدم الدماغي من خلال CCA.

وينبغي النظر في العديد من العيوب والعواقب السلبية المحتملة لهذا الحقن داخل الشرايين. وتتلقى الحيوانات عملية جراحية ثانية، والتي تحمل احتمال حدوث مضاعفات تتعلق بالتخدير أو الجراحة. يتم إزعاج تدفق الدم الدماغي من خلال CCA ipsilateral، وإن كان بشكل عابر (أقل من بضع دقائق)، مما قد يؤدي إلى حلقة عابرة أخرى من الاكتئاب خفيفة من CBF. بالإضافة إلى ذلك، اضطراب BBB أو فتح أمر بالغ الأهمية للتسليم داخل الشرايين NSC، مما يحد من النافذة العلاجية. في الدراسة التجريبية، لم يتم اكتشاف أي مراكز رابطة الـ GFP (+) تقريبًا في الدماغ الساذج بعد الحقن داخل الشرايين. ومع ذلك، إذا كان هذا الموضوع يمكن أن يتسامح مع الأدوية التي يمكن أن تفتح بشكل عابر BBB، مثل المنيتول عالية أو محلول ملحي، وهذا يمكن أن تستخدم لإنشاء نافذة عابرة من فتح BBB لحقن NSC في وقت لاحق. في الدراسات الأولية، وجدنا أن الحقن داخل الشريان داخل أول 6 ح بعد السكتة الدماغية أدى إلى ارتفاع معدل الوفيات مما لوحظ مع السكتة الدماغية وحدها. قد يكون هذا مرتبطًا بعملية جراحية جراحية ثانية بعد فترة قصيرة نسبيًا من التعافي بعد الجراحة الأولى. بدلا من ذلك، بعد إهانة الإقفاري، قد يكون لدى المخ الوعائي المصاب ميل أعلى للانقباض استجابة لأي محفزات إضافية، مثل إدخال القسطرة، أو تحميل السوائل الإضافية، أو تعلق NSCs الخارجية على الحائط اللامع بعد الحقن. قلق معقول آخر بشأن التسليم NSC بعد السكتة الدماغية هو أن NSCs يمكن أن تشكل emboli أن مزيد من الانسداد أو إزعاج microvessels. في الاتفاق مع التقارير السابقة8,16,24, لم نجد أدلة هامة من GFP (+) إمبولي في الأوعية الدقيقة, على الرغم من أننا لم تجد GFP (+) NSCs في الفضاء perivascular (Virchow-روبن الفضاء) في الأيام الأولى بعد الحقن. بعد أن قمنا بتحسين النافذة الزمنية للحقن ، لم يكن هناك فرق في معدل المضاعفات أو الوفيات بين مجموعات السكتة الدماغية التي تلقت حقن السيارة أو NSC في الدراسة الحالية. لذلك، يتم تصميم الحقن داخل الشرايين NSC بشكل صحيح هو طريقة آمنة وفعالة لعلاج NSC التي تستهدف الأمراض العصبية.

لتحقيق الحقن الناجح لـ NSC وتحسين النتائج الحيوانية ، يجب التعامل مع العديد من الجوانب بحذر أثناء جراحة السكتة الدماغية أو حقن NSC. وينبغي ممارسة الدعم الجراحي العام والرعاية، مثل حماية القرنية والحفاظ على درجة الحرارة الأساسية. هنا نقدم بعض المضاعفات المحتملة لهذه الجراحة والتوجيهات المحددة لتقليل حدوثها.

يمكن أن يكون هناك ضغط على العصب المبهم. أثناء الجراحة ، لا ينبغي أن تمتد العصب المبهم ، وسحق ، وربط أو تحفيز. يمكن أن التحفيز العرضي للأعصاب المبهمة التي تحفز عدم انتظام ضربات القلب مثل بطء القلب أو السكتة القلبية أو حتى الموت.

وضع غير لائق أو تشديد خياطة, أو في غير محله أو انزلاق من مقطع الأوعية قد يؤدي إلى نزيف الشرايين من نهاية قريبة من CCA (من إخراج القلب) أو نهاية من خلال نهاية حلقة ويليس. في كل خطوة، تأكد من أن مقطع السفينة أو عقدة توضع بشكل صحيح لتكديس تدفق الدم. إذا حدث نزيف، حاول استعادة الموضع الصحيح للعقدة أو مقاطع الوعاء. إذا كان المجال البصري غير واضح مع الدم، وضع غيض من مسحة القطن العقيمة على CCA وعقد مع الضغط لوقف تدفق الدم. الهيموجلوبين من النزيف سوف تسهل إغلاق شق على الشريان. بعد توقف النزيف، قم بتشد العقدة أو وضع مقطع الوعاء في الموقع الصحيح، وتنظيف الدم في المجال البصري ومواصلة الجراحة.

يمكن أن تكون هناك إصابات أو مضاعفات من إدخال القسطرة. تقليم طرف MRE010 في زاوية 45 درجة، بحيث يمكن أن تدخل شق صغير على الشريان بسهولة، دون إحداث أي إصابة في السفينة. في حالات نادرة، قد يُخترق طرف أكثر من شحذ الشريان أو يدخل الفراغ بين غشاء الطابق السفلي و الزفير التونيكا. لتجنب هذه الإصابات، قم بإجراء شق بالحجم المناسب على الشريان. نوصي بحجم 1/4-1/3 محيط الشريان، وهو كبير بما يكفي للسماح بدخول طرف القسطرة، ولكنه يحتفظ بقوة كافية في جدار الوعاء للالتفاف خارج القسطرة. قد يؤدي شق كبير جدًا إلى تمزق الشريان في موقع الشق. توجيه بلطف تلميح القسطرة MRE010 للدخول في شق. لا تجبر على دخول طرف القسطرة أو تقدم القسطرة. إذا لزم الأمر، يمكن استخدام ملقط حادة لرفع حافة الشق. تقدم القسطرة بزاوية منخفضة بالنسبة إلى الشريان بحيث تكون القسطرة والشريان متوازيين تقريبًا.

وهناك أيضا مضاعفات محتملة ذات صلة بالحقن. من المضاعفات الشائعة من الحقن داخل الشرايين هو التحميل الزائد للحجم ، والذي يمكن أن يؤدي إلى زيادة القلب الحادة وذمة الرئة. يمكن أن تضخيم معدلات الحقن السريع هذه المخاطر وتسبب ضررا على جدار السفينة8. وهكذا، ينبغي التحكم بعناية في كل من المعدل والحجم الإجمالي. نوصي 20 ميكرولتر/ دقيقة آمنة عموماً للفئران عند استخدامها على مدى فترة قصيرة مثل 5 دقائق. إذا لوحظت أعراض الحمل الزائد لحجم، مثل سريعة، والتنفس الضحلة، والفقاعات الوردي من nares، أو حركة شاذة مثل dysphoria، يجب إيقاف الحقن أو إحباط، والحيوانات يسمح لاسترداد. ومن المضاعفات المحتملة الأخرى تشكيل مستو في الجهاز العصبي غير المُعَدَّ في الجهاز الدماغي الوعائي. يجب أن لا يحتوي محلول التعليق على الكالسيوم أو المغنيسيوم ، والتي من المعروف أنها تعزز تجميع الخلايا. لتقليل فرص تحريض emboli، يجب فحص تعليق خلية واحدة من NSCs تحت المجهر قبل الحقن فقط لتأكيد عدم وجود مجموعات الخلايا. إذا كانت مجموعات الخلايا موجودة، titrate مع أنبوب 1 مل عقيمة حتى يتحقق تعليق خلية واحدة.

تحدد هذه الدراسة جدوى نهج التسليم داخل الشرايين للفئران والجرذان، وتكشف عن العديد من السمات الهامة لهذا الحقن داخل الشرايين من NSCs في سياق السكتة الدماغية الإقفارية. بالمقارنة مع التوزيع البؤري نسبيا من NSCs البقاء على قيد الحياة في الدماغ parenchyma ذكرت عادة مع الحقن داخل الدماغ1,7,9,11,15,16, لاحظنا توزيع منتشر في جميع أنحاء نصف الكرة الأرضية ipsilateral, بما في ذلك القشرة, قرن آمون وsstriatum. وهكذا، والتسليم داخل الشرايين هو مناسبة تماما ليس فقط للسكتة الدماغية، ولكن أيضا لأنواع الإصابات المتعددة أو الأمراض التي تنطوي على تلف الدماغ منتشر. وفي إطار مركز MCAO، وجد أعلى تركيز لـ NSCs على طول حافة موقع الإصابة. وقد تكون زيادة كثافة المراكز غير المحددة المنشأ في منطقة البنمبرا ناتجة عن زيادة التسليم إلى هذه المنطقة عن طريق التدفق الجانبي من إعادة ضخ الدم وفتح BBB وكذلك هجرة NSCs نحو المنطقة المتضررة. على الرغم من أن التسليم الرابع من SCs يمكن أن يؤدي إلى توزيع منتشر, ويقدر عدد الخلايا التي تصل إلى الدماغ أن يكون جزءا صغيرا من مجموع تسليم, ويرجع ذلك جزئيا إلى الترشيح من قبل الأجهزة الطرفية8,13. استنادا إلى دراسة سابقة على الانبثاث الدماغ12, حقن داخل الشرايين لوسيفراز المسمى D122 الخلايا السرطانية استفادت من تأثير تمرير الأول ليستقر في الأوعية الدموية الدماغية وتطوير مواقع النقيلي في الدماغ بدلا من الأجهزة الطرفية. تم الكشف عن مواقع النقيلي الدماغي بسبب الخلايا السرطانية الخارجية في الدماغ ipsilateral للحقن في وقت مبكر من 1 أسبوع بعد الحقن باستخدام نظام التصوير IVIS للكشف عن إشارة الإضاءة الحيوية من خلال الجمجمة وفروة الرأس سليمة. وعلى النقيض من ذلك، لم يتم اكتشاف إشارات الإنارة (التي تشير إلى عبء الورم المرتبط بالخلايا السرطانية الخارجية) من الأعضاء الطرفية، مثل الكبد والرئة والعضلات، إلا بعد 3-4 أسابيع من الحقن داخل الشرايين. لذلك ، نتوقع ، في سيناريو مماثل ، فإن تسليم NSC داخل الشرايين سيستفيد أيضًا من تأثير التمرير الأول في الدورة الدموية الدماغية لزيادة التعريب إلى الدماغ بشكل كبير مقارنة بالأعضاء الطرفية.

على الرغم من أن الحقن داخل المخ مباشرة يمكن استخدامها لتقديم أعداد كبيرة من الخلايا إلى الدماغ المصاب، فإن النهج يؤدي إلى تلف الخلايا أو النزيف بسبب اختراق إبرة البارينتشيما التي تؤدي إلى توطين الأعصاب، مما قد يعرض للخطر البقاء على قيد الحياة والتكامل للخلايا التي تم تسليمها حديثا14،15،16،,26.26 النهج داخل الشرايين لتسليم NSC مفيد في أنه يتجنب هذا الضرر في الدماغ الموضعية واعصاب الفلوراميشن، ويدعم البقاء على المدى الطويل من NSCs3،8،9،14،24. لاحظنا البقاء على قيد الحياة والتمايز من حقن GPF-NSCs في الدماغ المصاب في الوقت نقاط تصل إلى 30 د بعد الحقن. على الرغم من أننا وجدنا NSCs التي كانت قد تمايزت إلى الخلايا العصبية الناضجة والخلايا الفلكية، هناك حاجة إلى دراسات مفصلة لتحديد التوزيع النسبي لأنواع الخلايا المختلفة التي تم إنشاؤها من GFP-NSCs والنسب التي البقاء على قيد الحياة في فترة ما بعد الظهر المزمنة. والأهم من ذلك، ما إذا كان بإمكان مراكز الاتصال العصبية الخارجية البقاء على قيد الحياة والتفاعل مع خلايا الدماغ المكونة لإعادة بناء الشبكة الدماغية وتغيير الوظيفة العصبية، لا يزال غير واضح وينبغي استكشافه.

معا، ونحن نقدم طريقة التسليم داخل الشرايين لتقديم NSCs في الدماغ الإقفاري، مما يدل على البقاء على المدى الطويل في نصف الكرة الأرضية الإقفارية والتمايز في أنواع الخلايا العصبية والزبقية. نهج التسليم داخل الشرايين قابل للتكيف لأنواع عديدة ونماذج متعددة من إصابة الجهاز العصبي المركزي والمرض ويمكن استخدامها لإيصال أنواع الخلايا الأخرى أو المركبات العلاجية أو البيولوجية واحدة أو متعددة، وتوفير فائدة واسعة لمجتمع علم الأعصاب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

اي.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا البحث من قبل ما يلي: جائزة AHA 14SDG20480186 لLC، فريق الابتكار الموضوع من جامعة شانشي للطب الصيني 2019-QN07 لBZ، والحبل الشوكي كنتاكي والرأس البحوث منحة 14-12A لKES وLC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305175 preparation of injection catheter
26 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305111 preparation of injection catheter
27 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305136 preparation of injection catheter
4-0 NFS-2 suture with needle Henry Schein Animal Health 56905 surgery
6-0 nylon suture Teleflex/Braintree Scientific 104-s surgery
Accutase STEMCELL Technologies 7922 cell detachment solution
blade Bard-Parker 10 surgery
Buprenorphine-SR Lab ZooPharm Buprenorphine-SR Lab® analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)
Calcium/magnisum free PBS VWR 02-0119-0500 NSC dissociation
DCX antibody Millipore AB2253 immunostaining
GFAP antibody Invitrogen 180063 immunostaining
Isoflurane Henry Schein Animal Health 50562-1 surgery
MCAO filament for mouse Doccol 702223PK5Re surgery
MCAO filament for rat Doccol 503334PK5Re surgery
MRE010 catheter Braintree Scientific MRE010 preparation of injection catheter
MRE025 catheter Braintree Scientific MRE025 preparation of injection catheter
MRE050 catheter Braintree Scientific MRE050 preparation of injection catheter
Nu-Tears Ointment NuLife Pharmaceuticals Nu-Tears Ointment eye care during surgery
S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled Fine Science Tools 00649-11 surgery
S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight Fine Science Tools 00632-11 surgery
Superglue Pacer Technology 15187 preparation of injection catheter
syringe pump Kent Scientific GenieTouch surgery
Tuj1 antibody Millipore MAb1637 immunostaining
two-component 5 minute epoxy Devcon 20445 preparation of injection catheter
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-08 surgery
vascular clamps Fine Science Tools 00400-03 surgery
Zeiss microscope Zeiss Axio Imager 2 microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
  2. Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
  3. Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154 (2018).
  4. Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
  5. Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
  6. Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
  7. Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
  8. Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
  9. Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
  10. Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758 (2017).
  11. Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
  12. Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
  13. Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
  14. Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
  15. Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. Intracranial delivery of stem cells. Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).
  16. Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).
  17. Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
  18. Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967 (2015).
  19. Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
  20. Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001 (2013).
  22. Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. (2017).
  23. Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. (2017).
  24. Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
  25. Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
  26. Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics