Author Produced

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

JoVE Journal
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

神経幹細胞を送達する方法は、注射液または懸濁液に適応可能で、虚血性脳卒中後に一般的な頸動脈(マウス)または外頸動脈(ラット)を介して報告される。注入された細胞は脳のパレンチマ全体に広く分布し、送達後30dまで検出することができる。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, B., Joseph, B., Saatman, K. E., Chen, L. Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (160), e61119, doi:10.3791/61119 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

神経幹細胞(NSC)療法は、脳卒中、外傷性脳損傷および神経変性疾患のための新たな革新的な治療法である。頭蓋内分娩と比較して、NSCの動脈内投与は侵襲性が低く、脳の中でNSCのより拡散分布を生じる。また、動脈内送達は、脳循環における初回通過効果を可能にし、肝臓および脾臓などの末梢器官における細胞の捕捉の可能性を減少させ、末梢注射に伴う合併症である。ここでは、マウスとラットの両方において、虚血性脳卒中後の一般的な頸動脈(マウス)または外頸動脈(ラット)を介してNSCをイプシラテラ半球に送達するための方法論を詳述する。GFP標識NSCを用いて、虚血性損傷部位内または近傍の高密度で、死後1週間、1週間、4週間でげっ歯類の半球全体で達成された広範な分布を示す。長期生存に加えて、4週でGFP標識細胞の分化の証拠を示す。NSCに関してここで説明する動脈内送達アプローチは、治療化合物の投与にも使用することができ、したがって、複数の種にわたる様々なCNS傷害および疾患モデルに対する広範な適用性を有する。

Introduction

幹細胞(SC),療法は、脳卒中、頭部外傷および認知症,,11、2、3、4、5、62を含む神経疾患の治療として大きな可能性56秘めている。34しかし、病気の脳に外因性のSCを送達する効率的な方法は、問題が残る262、6、7、8、9、10、11、12、13。11,12,139,10,,7,8,,静脈内(IV)または腹腔内(IP)注射を含む末梢送達経路を介して送達されるSCは、特に肺、肝臓、脾臓および筋肉88、9、13、149,13,における微小循環におけるファーストパスフィルタリングの対象となり、非標的領域における細胞の蓄積の可能性が高まる。14侵襲的な脳内注射法は、局所的な脳組織損傷および注射,,,部位2、6、8、14、15、166,8付近のSCの非常に制限された分布をもたらす。2141516我々は最近、外因性神経SC(NSC)を送達するためのカテーテルベースの動脈内注入法を確立した。我々は、マウスまたはラット17、18、19,において左中大脳動脈(MCA)を閉塞するためにシリコーンゴム被覆フィラメントを用いて1つの半球で一過性(1時間)虚血再灌流傷害19誘発する。このモデルでは、レーザードップラーまたはレーザー斑点イメージング17、19,19を用いた半球の脳血流(CBF)の約75-85%のうつ病を再現的に観察し、一貫した神経障害17、18、1918,19を生み出した。17

時間節約のために、ビデオは通常の速度の2倍で再生するように設定されており、縫合糸による皮膚の準備や創傷閉鎖などの日常的な外科的処置と、電動シリンジポンプの使用とセットアップは提示されません。NSCの動脈内送達法は、げっ歯類における実験脳卒中の中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルの文脈で実証される。したがって、後で第2の手術、動脈内注射を、同じ動物上の前の外科部位を用いて行われる方法を実証するために、一過性の虚血性脳卒中手順を含む。げっ歯類の脳卒中モデルにおける動脈内NSC送達の実現可能性は、外因性NSCの分布および生存を評価することによって実証される。脳病理と神経機能障害を弱めるNSC療法の有効性は別々に報告される。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

動物の被験者に関するすべての手順は、ケンタッキー大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認され、手術に伴うストレスや痛みを最小限に抑えるために適切な注意を払った。

1. 注射カテーテルと手術用フックの調製

  1. 射出カテーテルを構築する(図1)。MRE010、MRE025、MRE050チューブ、20G、26Gおよび27G注射針(図2A)、600Figure 2Aグリットサンドペーパー、スーパーグルー、2成分5分エポキシを含む必要な材料を収集します。
    1. 針ハブから1cmで20Gと26Gの針を切り、サンドペーパーで端を磨きます(図2B)。針を10mLの二重蒸留水で洗い流し、針の穴をきれいにします。
      注: 2 つの異なるデザイン (図 1)が使用されています。設計1は単一のコネクタを備え、溶液または懸濁液の注入に使用されます。設計2は、細胞(20G針)の注入のための20 Gおよび26 G Luerロックコネクタを有し、NSC含有溶液の全容を確実に送達するために、死んだ容積(26G針)のフラッシュを有する。
  2. 設計1:3-4 cmの長さのMRE010カテーテルを15 cmの長さのMRE025カテーテルに挿入し、スーパーグルーでしっかりした。
    1. MRE025チューブの反対側をMRE050カテーテルのセグメントに接続し、スーパーグルーで固定します。鈍い20G針をMRE050カテーテルの残りの端に挿入し、スーパーグルーで固定する(図1)。
    2. さらにエポキシ接着剤との接続部位を強化します。このカテーテルの設計は試薬(化学薬品またはサイトカインのような他の生物学的製剤のような)の注入のために最適である。
  3. 設計2:3-4 cmの長さのMRE010カテーテルを15 cmの長さのMRE025カテーテルに挿入し、スーパーグルーでしっかりした。
    1. MRE025チューブの反対側をMRE050カテーテルのセグメントに接続し、スーパーグルーで固定します。鈍い20G針をMRE050カテーテルの残りの端に挿入し、スーパーグルーで固定します。
    2. 第1の針の先端付近のMRE050チューブに鈍い26G針を挿入し、注射の方向に従い、スーパーグルーで固定する(図1および図2C)。針とMRE050チューブのセグメントをクリアエポキシで補強する(図2C)。この設計により、針1(20G)を通してNSC注射後に針2(26G)を介して車両溶液を注入し、カテーテルの死量を脳循環に洗い流し、注入量をより正確に制御することができます。
    3. NSCへの損傷を最小限に抑えるために、NSC注射に20G針を使用し、生存率に悪影響を及ぼす可能性があります。
  4. 建設後、カテーテルを10mLの二重蒸留水で洗い流し、続いて70%エタノールを加え、一晩70%エタノールに浸します。
  5. 手術前に、70%エタノールからカテーテルを取り除き、10 mLの無菌PBSで洗い流し、貯蔵および輸送のためのオートクレーブ外科用ツールボックスに入れます。
  6. 外科用フックの準備
    1. 長さ1.5~2cmの長さの針シャフトを27Gの針から切り、両端を紙でくるまで磨きます。次に、小さな止血クランプを使用して、シャフトを一方の端のフックに、もう一方の端にリング形状を曲げてください。
    2. リングを通して10-15 cmの長さのMRE025カテーテルを挿入し、明確な外科テープでしっかり止めます(図2D)。同じ方法を使用して、さらに2つのフックを作成します。
    3. すべてのフックとカテーテルシステムを70%エタノールに浸して使用してください。

2. 動物の準備:配達、住宅、環境適応

  1. 雄および雌のC57BL/6マウス(10-12週、n=10/タイムポイント)およびウィスターラット(10-12週、n=10)をこの研究で使用した。
  2. 食品と水のアドリビタムと環境管理動物のビバリウムでそれらを収容します。
  3. 脳卒中手術の少なくとも1週間前に環境に適応することができます。
    注:脳卒中手術後1dで1人のマウスと1つのラットが死亡し、1つのマウスは重度の麻痺のために人道的な理由でNSC注射の前に3d脳卒中で安楽死させた。

3. マウスとラットの神経幹細胞(NSC)の培養

注: NSC は、確立されたプロトコル20に従って分離され、培養されました。

  1. マウス
    1. GFP陽性雄マウス(B6 ACTb-EGFP)と交配した時陽性の雌C57BL/6マウスからE18胚皮質から野生型(WT)およびGFP標識NSCを単離する。GFP(+)胚を同定するには、FITCチャネルを使用して蛍光顕微鏡で採取した胚を観察します。GFP(+)胚は緑色蛍光シグナルを生み出し、WT胚は弱い自己蛍光のみを示す(図3A)。
  2. ラット
    1. 若年成人WTラットの脳室下帯(SVZ)からNSCを分離する。メーカーの指示に従って注入する直前にDiIでそれらをラベル21。
  3. マウスまたはラットのNSCを神経球に発達するまで培養し、球体の直径が100μm前後に達するとそれらを通過させる(図3B)。3 と 5 の間の注入には NSC を使用します。
  4. 胚性幹細胞マーカーパネルを使用して幹細胞の特性を確認する(図3C)。
  5. 注射の日に、NSC球体を収集し、細胞剥離液との解離、カルシウムおよびマグネシウムフリーPBSで107細胞/mLの濃度に懸濁し、注入するまで湿った氷の上に置きます。

4. 外科手術

  1. 手術前に、挿入長さの手術中の参照のための先端から9 mm(マウスの場合)または15mm(ラット)の銀マーカーペンで商業MCAO縫合のドットをマークします。手術用具(はさみ、鉗子)と器具を各手術の前にオートクレーブし、操作の間にガラスビーズの殺菌器で加熱殺菌する。
  2. 吸入を介して5%イオブルランを有する動物に麻酔を誘発し、1-2%イオブルランで麻酔を維持する。全身の状態(呼吸パターン、ウィスカーの動き、自発的な身体矯正姿勢)、角膜反射、足指ピンチへの応答を観察して、麻酔の深さを評価します。
  3. 動物の仰向けを加熱パッドに置き、ベタジン溶液でクリッピングしてスクラブし、その後70%エタノールを続けて動物の外科部位を準備する。手術中に眼科軟膏(人工涙軟膏など)を塗布することで、動物の目を乾燥から保護します。
  4. 外科医に細菌のスクラブで手をこすり、マスク、無菌手袋、清潔なラボコートを着用してもらいます。

5. 中大脳動脈閉塞(MCAO)脳卒中手術

注:マウスまたはラットの1つの半球で虚血性脳卒中を誘発する手術は、縫合糸が血流を閉塞するために内部頸動脈(ICA)に導入されるという点で類似している(4)17、18、19、22。17,18,19,22しかしながら、縫合線挿入のために選択された動脈は、その後の幹細胞注入に必要な使用可能な操作スペースに基づいて異なる。ラットは、2つの別々の連続手術(脳卒中およびNSC注射)を可能にするために外部頸動脈(ECA)セグメントに十分なスペースを有するが、マウスは、代替アプローチを必要とする。脳卒中誘発脳血流変化、脳梗塞の大きさおよび神経学的欠損は、著者の以前の報告17、18、1918,19のように報告されている。17

  1. 虚血性脳卒中を誘発するために、頸部領域の中線切開、および左一般的な頸動脈(CCA)、ECAおよびICAの隔離を伴うマウスおよびラットの両方の手術を開始する(図4)。CCAや迷走神経を伸ばしたり、変位したり、圧迫したりしないように注意してください。動脈および手術ステップの選択はその後異なるため、マウスとラットのMCAO手術は別々に説明する。
  2. マウスのMCAO手術(図4A)
    1. CCAの下に3本編み6-0ナイロン縫合糸を置き(図4A、ステップ1)、近位弦を使用して分岐から可能な限り血管を閉塞させるために1つの密な外科結び目を作ります(図4A、ステップ2)。縫合端の端をトリムダウンします。
    2. CCAの遠位側でスリップノットを作成し(注意:ステップ6でリリースされるので過度に締め付けないでください)、2つの締め付けられたノット(図4A、ステップ2)の間に1つの緩いスリップノットを作成します。
    3. 小切開(~1/4~1/3周)をマイクロシザーでCCAの近似結び目に近いマイクロシザー(図4A、ステップ3)で切り取り、7-0固体ナイロン縫合糸をコーティングした市販のシリコーンゴムを慎重に挿入する(図4A、ステップ4)。この縫合糸を中央の紐で固定し、十分に締め付け(図4A、ステップ5)、ICAからの逆流によるシリコーンゴム被覆ナイロンフィラメントの動きを防ぎながら、ピンセットで穏やかな押し込みを行いながら、ECAに向かって縫合糸を進歩させます。
    4. 上部(遠位)スリップノット(図4A、ステップ6)を解除し、先端が9mm(縫合線の銀マーカーを基準として)分岐を通過するまでICAにナイロン縫合糸を進めます。縫合糸を確保し、血流を防ぐために、上の2つのスリップノットを締めます。
    5. フィラメント1時間後(図4A、ステップ7)を引き出し、出血を防ぐために真ん中の結び目を使用してCCAをリゲートします(図4A、ステップ5-7を逆順に、ステップ8に見られるように最終結果)。上の結び目を離します。4-0外科縫合で創傷を閉じる。
  3. ラットのMCAO手術(図4B)
    1. ECAの下に2本の編み込み6-0ナイロン縫合糸(図4B、ステップ1)を配置し、遠端に1つのタイトノットを可能な限り下にします(図4B、ステップ2)。
    2. 血管クリップをICAとCCAに置いて動脈血流を遮蔽する(図4B、ステップ3)。スリップノットは、容器クリップの代替として使用できます。
    3. マイクロシザー(図4B、ステップ3-4)でECAに小さな切開を行い、6-0ナイロンフィラメント(図4B、ステップ5)をコーティングした市販のシリコーンゴムを挿入し、ECAのスリップノットで適切に固定します。
    4. ICA上の容器クリップを外し、銀マーカー(15mm)が分岐に達するまでフィラメントをICAに進め(図4B、ステップ6)、ECA上の2番目の結び目で縫合を固定する(図4B、ステップ6)。
    5. 虚血の1時間後、このフィラメントを引き出し、切開をリゲートして出血を防ぎ(図4B、ステップ7)、CCAから血管クリップを取り除き(ステップ8の最終結果)、4-0外科縫合で創傷を閉じる。

6. 回復

  1. 脳卒中手術後、動物が意識を完全に取り戻すまで加熱パッドに置きます。
  2. 皮下注射で鎮痛を提供する。水と食べ物のアドリビタムにアクセスして、動物を自宅のケージに戻します。

7. 動脈内注射

  1. カテーテル全体を70%エタノールで洗い、使用するまで一晩浸します。注射の直前に、無菌シリンジで針のルアーロックを接続し、10 mLの滅菌PBSでカテーテルシステムの内腔側全体を洗浄します。
  2. NSCインジェクションの時間枠と準備
    注:他の研究チームの経験と報告に基づいて、NSC注射のタイミングは、被験者と外因性NSCの両方の生存のために重要です。我々の試験研究では、早期時点(再灌流後の最初の6時間以内)でのNSCの注入は、より高い死亡率につながった。したがって、後の注射時間ポイントを試験し、脳卒中後の2d(48時間)〜3d(72時間)の間のタイムウィンドウを決定し、NSCのイントラパレンキマル分布を達成するのに効率的である。
    1. マウスの場合は注射器ポンプの注入速度を20 μL/min、ラットの場合は50 μL/minに設定します。注射の速度や持続時間が過剰に増加すると、全身体積過負荷が起こり、マウスはラットよりも脆弱である。
    2. 簡単に言えば、脳卒中手術後の3dで、イオブルランで動物を麻酔し、加熱パッドに仰向けに置く。
    3. 子宮頸部創傷を再び開き、ECA、ICAおよびCCAを再び露出させる(図5、ステップ1)。脳卒中手術と同様に、種に基づいて注射経路を決定する。マウスでNSC注射用のCCAを、ラット23に対してECAを利用する。
  3. マウスのCCAを介した動脈内注射
    1. CCAの下に2つの6-0編み込みナイロン縫合糸を置きます。前の脳卒中手術の分岐と下の結び目の間に、それぞれとの間に緩いスリップノットを作成します(図5、ステップ2)。
    2. 上のスリップノットを締め、下の結び目の上に小さな切開を行います(図5、ステップ3)。切開部を通してMRE010カテーテルを挿入し(図5、ステップ4)、注入の流れを妨げずに中間結び目で固定します(図5、ステップ5)。上の結び目を解放し、カテーテルの位置を調整するとき、血液の背流はカテーテルで見えるべきである。
    3. ECAに容器クリップを置き、このカテーテルを通して1 x 106 GFP-NSCを注射器ポンプで5分間5分間、同じ速度で50-100 μLのフラッシュを注入します。
    4. 注射後、上部のスリップ結び目で上のCCAをリゲートし、MRE010カテーテルを引き出します(図5、ステップ6)。中央ノットと上のノットを締め、トリムします。ECAから容器クリップを取り外します。図 5の最終画像を参照してください。.
    5. 4-0外科縫合で創傷を閉じる。
    6. 加熱パッドと皮下鎮痛注射で十分な回復を提供した後、動物を自宅のケージに戻します。
  4. ラットのECAを介した動脈内注射
    1. ECA と CCA を容器クリップで一時的に遮蔽します(図 5、ステップ 2)。
    2. ECAの近位側(図5、ステップ3)で小切開を行い、MRE010カテーテルを挿入し、結び目で固定する(図5、ステップ4)。
    3. 両方の容器クリップを取り外し、50 μL/minで50μLのPBSに5 x 106 NSCを2分間注入し、その後に50-100 μLのPBS(図5、ステップ5)を同じ速度でフラッシュし、電動シリンジポンプを使用します。
    4. 注射後、CCAとECAを再び容器クリップで閉塞し、注射カテーテルの離脱後に2番目の切開の近位側でECAをリゲートする(図5、ステップ6)。
    5. 2つの容器クリップ(図5、ステップ7)を取り外し、4-0の外科縫合で傷口を閉じます。
    6. 加熱パッドと皮下鎮痛注射で十分な回復を提供した後、動物を自宅のケージに戻します。
  5. 組織学的アッセイ
    1. 虚血性脳卒中を受けたマウスおよびラットから脳を採取し、安楽死後にNSCまたは車両溶液を注射し、1d(マウスおよびラット)で4%パラホルムアルデヒド、7d(マウス)、注射後30d(マウス)で心臓内灌流を行う。これらの4つのグループのそれぞれは、5 NSCと5つの車両注入動物で構成されていました。
    2. 一晩脳を固定し、3dのための30%スクロースで凍結保存します。
    3. 脳をOCTに埋め込み、厚さ40μmでスライスし、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP、アストロサイト)、Tuj1(成熟ニューロン)、ダブルコルチン(DCX、未熟ニューロン)を含む細胞特異的マーカーで免疫染色後のNSCの分布を調べる。
      注:GFPを発現するラット株がないため、比較的短期間の観察しかできない一過性蛍光標識であるDiIを利用しました。したがって、NSC分布はラットの脳卒中後1dでしか調べなかった。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GFP標識NSCは虚血性脳、主に半球、特に半影、および傷害縁に沿って容易に検出された(図6)。検査者は、イメージングおよび分析中に単盲であった。

例えば、注射後1dで、マウス海馬内でNSCが検出された。NSCのサブセットは、この初期時点においてもデンテート回における未熟なニューロンマーカーDCXの共発現を示した(図6A)。

脳卒中後10d(NSC注射後7d)において、外因性GFP-NSCは線条体および皮質における損傷の縁(流域領域)で最も高い密度で観察された(図6B)。注射後7dまでに多くのGFP-NSCもDCX(青い円で示される)を発現し、その神経の運命を示す。車両溶液注射を受けた動物と比較して、NSC注射はまた、半球の間でDCX染色(赤)を増加させた。

注射後30dで、NSCは依然として負傷した皮質で検出され、その一部はグリアマーカーGFAP(図6C)または成熟した神経マーカーTuj1(図6D)の発現を示し、外因性NSCがグリアまたは神経細胞の運命に分化し、負傷した脳で最大1ヶ月生存する可能性を示した。

Figure 1
図1:注入カテーテルの概略設計。複合液注入用の設計1と細胞注入用の設計2の2つのデザインを紹介します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:NSC注射用カテーテルの調製と手術用フックの調製(A)カテーテル構造のための材料:MRE010、MRE025およびMRE050カテーテルは3 cm、~10-15 cm、そして3cmの長さそれぞれである。(B)針先を切り落とし、鈍くなるまで磨く。(C)各セグメントを接続し、スーパーグルーで固定し、強化のためにエポキシにニードルルアーロックとMRE050セグメントの両方を埋め込みます。(D)27 G針シャフトとMRE025カテーテルを使用して外科用フックを作ります。スケールバー: 5 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:GFP(+)神経幹細胞の培養(A) FITCチャネルを用いて蛍光顕微鏡でGFP(+)胚を同定する。(B) 神経球を形成するまで分離皮質NSCを培養する。スケールバー:100μm(C)幹細胞マーカーパネルを使用して神経球特性を調べる。Cスケールバー:50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:マウスまたはラットのステップバイステップ中大脳動脈閉塞(MCAO)脳卒中手術の模式図。詳細な手術については、ビデオを参照してください。ICA, 内頸動脈;ECA, 外的頸動脈;CCA、一般的な頸動脈。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:マウスまたはラットにおける動脈内神経幹細胞(NSC)注射の模式図。詳細な手術については、ビデオを参照してください。ICA, 内頸動脈;ECA, 外的頸動脈;CCA、一般的な頸動脈。緑色の矢印は、射出中の流れの方向を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:虚血性脳における神経幹細胞(NSC)の分布、生存および分化(注射後 1 d の海馬デンテート回内の GFP (+) NSC の検出.幹細胞は緑色に蛍光を発する。ダブルコルチン(DCX)は、赤色で示す免疫染色。白い矢印は、DCX 式を持つ GFP (+) NSC を示します。(B)シャムコントロール(注射なし)および車両(I-R)またはNSC(I-R+NSC)でイッシュ血症再灌流(I-R)後10dでGFP(+)細胞およびDCX標識細胞の模式図(I-R+ NSC)がマウスを注射した。虚血性侮辱の地形は最後の概略図に描かれて、明るいオレンジと濃いオレンジがそれぞれ虚血性の挑戦と壊死コアの対象となる領域を表す。青いリボンは「流域」領域を示します。灰色の四角形は、 (C) および (D) のイメージが撮影された場所を示しています。(C,D)外因性NSCは、分化してグリア運命(GFAP、C)またはニューロンの運命(Tuj1,D)を送達後30dまでに分化することができる。車両注射を受けた脳卒中動物(CおよびDの車両)ではFITC(GFP)チャネルでは有意なシグナルは認められなかったが、NSCではマウスを注射し、生き残ったGFP-NSCをGFAP(C)またはTuj1(D)染色と共局化した。CD矢印は2チャンネルのオーバーレイを示します。スケールバー:20 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

神経疾患の幹細胞療法はまだ初期の探索段階にあります。1つの大きな問題は、脳内にSCまたはNSCを十分に送達するための確立された方法が存在しないです。

外因性SC/NSCは、静脈内(IV)、腹腔内(IP)または脳内注射に続く脳内で検出することができるが、各送達アプローチには欠点がある。脳内の検出可能な集団は、末梢注射(IVまたはIP)で非常に低いと推定され、注入または注入された細胞のほんの一部を表す。脳内注射は非常に焦点的な分布を生じ、脳損傷直接誘発する可能性があります2,6,7,8,9,10,11,12,13.12そこで、虚血性脳卒中後のNSC送達の代替方法として動脈内注射の実施可能性を試験した。この方法は、脳卒中の侮辱の後に、脳内の脳の灌流を通してNSCを提供する。脳卒中後に早期に注射すると、外因性NSCは破壊された血液脳関門(BBB)を越え、脳全体に広い分布を達成することができる。動脈内注射の利点の1つは、CNS内のファーストパス効果を利用し、肺や肝臓などの濾過器官の豊富な微小循環を細胞が最初に通過する末梢送達経路とは対照的に、外因性NSCが脳に落ち着く可能性を最大限に引き出すことである。

ここで説明する動脈内アプローチは汎用性が高く、さまざまな種類の送達パラダイムや傷害または疾患モデルに適応することができます。現在の研究では1回の動脈内注射のみが行われているが、MRE025カテーテルは皮下に埋め込まれたマイクロポートに接続することができ、それを介して動物は繰り返し動脈内注射12を受けることができる。さらに、より単純な単一のルーメン設計により、この注入方法は、溶液12、23,23中の試薬の送達に使用することができる。複数の治療の送達が必要な場合、二重ルーメン設計は、第2の薬剤または化合物と同時または逐次的に初期溶液を提供するために利用することができる。最初の脳卒中手術を必要としない神経変性または外傷性脳損傷のげっ歯類モデルへの適用のために、マウスに注射カテーテルを設置するための手術はECA(ラットと同じプロトコル、マウスのステップ7.4の注射量および速度を適切に調整する)で行うことができるので、CCAを通る脳血流の潜在的な妨害を避ける。

いくつかの欠点と、この動脈内注射の潜在的な悪影響を考慮する必要があります。.動物は、麻酔や手術に関連する合併症の可能性を運ぶ第二の手術を受けます。一過性(数分未満)ではあるが、一過性ではあるが、脳血流は、CBFの軽度のうつ病の別の一過性のエピソードを誘発する可能性があるが、妨げられる。さらに、BBBの妨害または開口は、治療ウィンドウを制限する動脈内NSC送達にとって重要である。パイロット研究では、動脈内注射後のナイーブ脳でGFP(+)NSCはほとんど検出されなかった。しかし、高い浸透圧マンニートールや生理食音などのBBBを一時的に開くことができる薬を許容できる場合、これは後の時点でNSC注射のためのBBB開口部の一過性の窓を作成するために使用することができます。予備的な研究では、脳卒中後の最初の6時間以内に動脈内注射が脳卒中だけで観察されたよりも高い死亡率をもたらしたことを発見しました。これは、最初の手術後に比較的短い回復期間の後の第二の侵襲的手術に関連している可能性があります。あるいは、虚血性侮辱の後、負傷したセレブロバスキュラチュアは、カテーテルの導入、追加の流体負荷、または注射後の外因性NSCの外因性NSCの付着など、追加の刺激に応じて収縮する傾向が高い可能性がある。脳卒中後のNSC送達に関するもう一つの合理的な懸念は、NSCがマイクロ血管をさらに閉塞または妨害する塞栓を形成する可能性があるということです。以前のレポート88、16、2416,24と一致して、我々は注射後の初期の初期に血管内空間(Virchow-Robin空間)にGFP(+)NSCを発見したが、微小血管系におけるGFP(+)塞栓の有意な証拠を見つけ出さなかった。注射の時間枠を最適化した後、現在の研究で車両またはNSC注射を受けた脳卒中群間の合併症または死亡率に違いはありませんでした。したがって、適切に設計された動脈内NSC注射は、神経疾患を標的とするNSC治療の安全かつ効率的な方法である。

NSC注射を成功させ、動物の転帰を改善するためには、脳卒中手術やNSC注射中に注意して対処する必要があります。角膜の保護やコア温度の維持など、一般的な外科的支援とケアを実施する必要があります。ここでは、この特定の手術のいくつかの潜在的な合併症を紹介し、その発生を最小限に抑えるためのガイダンスを紹介します。

迷走神経にストレスが発生する可能性があります。手術中、迷走神経は伸ばしたり、押しつぶしたり、結紮したり、刺激したりしてはならない。迷走神経の偶発的な刺激は、徐脈、心停止、あるいは死のような不整脈を誘発し得る。

縫合糸の不適切な配置または締め付け、または血管クリップの誤配置またはスリップは、CCAの近位端(心拍出量から)またはウィリスの円を通る遠位端からの動脈出血をもたらす可能性がある。各ステップで、血管クリップまたは結び目が血流を妨げるために適切に配置されていることを確認します。出血が発生した場合は、結び目または容器クリップの正しい配置を復元してみてください。視野が血液でぼやけている場合は、CCAに無菌綿棒の先端を置き、血流を止めるために圧力で保持します。出血によるヘモグロビンは、動脈の切開の閉鎖を促進する。出血が止まったら、結び目を締めたり、血管クリップを正しい場所に置いたり、視野の血液をきれいにして手術を続けます。

カテーテルの挿入による傷害または合併症がある場合があります。MRE010先端を45°の角度でトリムするので、血管損傷を誘発することなく、動脈の小さな切開部に簡単に入ることができます。まれに、過度に研がれた先端が動脈に浸透したり、膜とチュニカ・エクステルナの間の空間に入ったりすることがあります。これらの損傷を避けるために、動脈に適切なサイズの切開を行います。カテーテル先端の侵入を可能にするのに十分な大きさである動脈の周りを1/4-1/3の大きさをお勧めしますが、血管壁にはカテーテルの外側に包まれるのに十分な強度を保持します。切開が大きすぎると、切開部位で動脈が裂ける可能性があります。MRE010カテーテル先端を静かに導いて切開を行います。カテーテル先端の侵入やカテーテルの進行を強制しないでください。必要に応じて、鋭利な鉗子を使用して切開部の端を持ち上げることができる。カテーテルと動脈がほぼ平行になるように、動脈に対して低角度でカテーテルを進めます。

潜在的な注射関連の合併症もあります。.動脈内注射による一般的な合併症の1つは、過度の体積負荷であり、急性心臓過負荷および肺水腫を引き起こす可能性がある。急速な注入率はこれらの危険を増幅し、容器の壁8に損傷を引き起こす可能性がある。したがって、レートと総体積の両方を慎重に制御する必要があります。5分間など短時間で使用する場合は、マウスに対して一般的に安全な20μL/minを推奨します。急速な、浅い呼吸、ナレスからのピンクの泡、または異性感の異常な動きのようなボリューム過負荷の症状が指摘された場合、注射を停止または中止し、動物は回復を許可する。もう一つの可能な合併症は、脳血管系におけるNSC塞栓症の形成である。懸濁液は、細胞凝集を促進することが知られているカルシウムまたはマグネシウムを含んではなりません。塞栓を誘発する可能性を減らすために、NSCの単一細胞懸濁液を注入直前に顕微鏡で調べ、細胞クラスターの存在を確認する必要があります。細胞クラスターが存在する場合、単一細胞懸濁液が達成されるまで滅菌1mLピペットで硝酸塩を有する。

本研究は、マウスおよびラットの動脈内送達アプローチの実現可能性を確立し、虚血性脳卒中の文脈におけるNSCのこの動脈内注射のいくつかの重要な特徴を明らかにする。脳内パレンチマで生き残ったNSCの比較的焦点的分布と比較して、脳内,注射1、7、9、11、15、167,9で報告されるが、皮質、海馬および線条体を含む半球全体の拡散分布を観察,16した。11,151したがって、動脈内送達は、脳卒中だけでなく、複数の傷害タイプまたはびまん性脳損傷を伴う疾患にも適している。MCAOの設定では、NSCの濃度が最も高いのが、損傷部位の縁に沿って発見された。半隔ゾーンにおける外因性NSCの密度の増加は、BBBの再確立された輸血および開口からの担保流を介してこの領域への送達が増加し、損傷した領域に向けてNSCが移動したためである可能性がある。SCのIV送達は拡散分布をもたらし得るが、脳に到達する細胞の数は、末梢器官88、1313による濾過による一部、全送物のほんの一部であると推定される。脳転移12に関する以前の研究に基づいて、動脈内注入されたルシファーゼ標識D122腫瘍細胞は、最初の通過効果を利用して脳血管構造に落ち着き、末梢器官ではなく脳内の転移部位を発達させた。外因性腫瘍細胞による脳転移部位は、インジェクション後早くも1週間の注射に対する脳内で、インタクトな頭蓋骨および頭皮を通して生物発光シグナルを検出するために、インジェクション後1週間で検出された。これに対し、肝臓、肺、筋肉などの末梢器官からの発光シグナル(外因性腫瘍細胞に関連する腫瘍の負担を示す)は、動脈内注射後3~4週間まで検出されなかった。したがって、同様のシナリオでは、動脈内NSC送達は脳循環におけるファーストパス効果の恩恵を受け、末梢器官と比較して脳への局在化を大幅に増加させると予想されます。

直接脳内注射は、損傷した脳に多数の細胞を送達するために使用することができるが、このアプローチは、局在性神経炎症を引き起こすパレンチマの針の浸透による細胞損傷または出血をもたらし、新たに送達された細胞1414、15、16、25、2615,16,の生存および統合を損なう可能性がある。25,26NSC送達のための動脈内アプローチは、この局所的な脳損傷および神経炎症を回避し、NSC3、8、9、14、24の長期生存をサポートするという点で有利である。3,8,9,14,24我々は、注射後30dまでの時点で、負傷した脳内に注入されたGPF-NSCの生存と分化を観察した。成熟したニューロンとアストロサイトに分化したNSCを発見しましたが、GFP-NSCから生成された様々な細胞タイプの相対的分布と慢性傷害後の期間に生き残る割合を決定するために詳細な研究が必要です。さらに重要なことは、生き残った外因性のNSCが脳ネットワークを再構築し、神経機能を変化させるために構成脳細胞と相互作用できるかどうかはまだ不明であり、探求されるべきである。

一緒に考えて、脳虚血性脳にNSCを送達する動脈内送達法を導入し、虚血性半球における長期生存と神経細胞およびグリア細胞型への分化を実証する。動脈内送達アプローチは、多数の種および複数のモデルのCNS傷害および疾患に適応可能であり、他の細胞タイプまたは単一または複数の治療化合物または生物学的製剤の送達に使用することができ、神経科学コミュニティに広範な有用性を提供する。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

なし。

Acknowledgments

この研究は、LCのAHA賞14SDG20480186、中国医学大学2019-QN07のBZの主題イノベーションチーム、KESとLCのためのケンタッキー脊髄および頭部外傷研究信託助成金14-12Aによって支えられた。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305175 preparation of injection catheter
26 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305111 preparation of injection catheter
27 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305136 preparation of injection catheter
4-0 NFS-2 suture with needle Henry Schein Animal Health 56905 surgery
6-0 nylon suture Teleflex/Braintree Scientific 104-s surgery
Accutase STEMCELL Technologies 7922 cell detachment solution
blade Bard-Parker 10 surgery
Buprenorphine-SR Lab ZooPharm Buprenorphine-SR Lab® analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)
Calcium/magnisum free PBS VWR 02-0119-0500 NSC dissociation
DCX antibody Millipore AB2253 immunostaining
GFAP antibody Invitrogen 180063 immunostaining
Isoflurane Henry Schein Animal Health 50562-1 surgery
MCAO filament for mouse Doccol 702223PK5Re surgery
MCAO filament for rat Doccol 503334PK5Re surgery
MRE010 catheter Braintree Scientific MRE010 preparation of injection catheter
MRE025 catheter Braintree Scientific MRE025 preparation of injection catheter
MRE050 catheter Braintree Scientific MRE050 preparation of injection catheter
Nu-Tears Ointment NuLife Pharmaceuticals Nu-Tears Ointment eye care during surgery
S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled Fine Science Tools 00649-11 surgery
S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight Fine Science Tools 00632-11 surgery
Superglue Pacer Technology 15187 preparation of injection catheter
syringe pump Kent Scientific GenieTouch surgery
Tuj1 antibody Millipore MAb1637 immunostaining
two-component 5 minute epoxy Devcon 20445 preparation of injection catheter
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-08 surgery
vascular clamps Fine Science Tools 00400-03 surgery
Zeiss microscope Zeiss Axio Imager 2 microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
  2. Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
  3. Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154 (2018).
  4. Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
  5. Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
  6. Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
  7. Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
  8. Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
  9. Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
  10. Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758 (2017).
  11. Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
  12. Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
  13. Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
  14. Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
  15. Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. Intracranial delivery of stem cells. Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).
  16. Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).
  17. Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
  18. Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967 (2015).
  19. Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
  20. Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001 (2013).
  22. Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. (2017).
  23. Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. (2017).
  24. Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
  25. Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
  26. Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics