Assay für Adhäsion und Agar Invasion in S. cerevisiae

Biology

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Summary

Wir beschreiben eine qualitative Tests für Hefe Haftung und Agar-Invasion als Maß für die invasive und pseudohyphal Differenzierung. Dieser einfache Test kann verwendet werden, um den invasiven Phänotyp der verschiedenen Mutanten sowie die Auswirkungen Umweltreize zu bewerten und Signalwege auf Hefe Differenzierung.

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Guldal, C. G., Broach, J. Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae. J. Vis. Exp. (1), e64, doi:10.3791/64 (2006).

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Abstract

Hefen sind in natürlichen Biofilmen, wo viele Mikroorganismen besiedeln Oberflächen gefunden. In künstlichen Umgebungen, wie z. B. Oberflächen von künstlichen Objekten können Biofilme vermindern die Produktivität der Industrie, zu zerstören Strukturen und bedrohen Menschenleben. 1-3 auf der anderen Seite kann sich die Leistung von Biofilmen zu helfen reinigen Sie die Umwelt und die Erzeugung nachhaltiger Energie. 4-8 Die Fähigkeit von S. cerevisiae, um Oberflächen zu besiedeln und an komplexen Biofilmen wurde meist bis zur Wiederentdeckung der Differenzierung Programme von verschiedenen Signalwegen und Umweltreize in diesem Organismus ausgelöst ignoriert. 9, 10 Die anhaltende Interesse an der Verwendung von S. cerevisiae als Modellorganismus, um das Zusammenspiel und die Konvergenz der Signalwege, wie die Ras-PKA, KSS1 MAPK und Hog1 Osmolarität Wege, schnell platziert S. cerevisiae in der Kreuzung der Biofilm verstehen Biologie und Signaltransduktion Forschung. 11-20 Zu diesem Zweck wurde die Differenzierung von Hefezellen in lange, Kleber, pseudohyphal Filamente eine bequeme Ablesung für die Aktivierung der Signalwege auf verschiedene Veränderungen der Umwelt. Allerdings ist Filamentierung eine komplexe Sammlung von Phänotypen, die für ihn Testen macht, als ob es eine einfache Phänotyp irreführend waren. In den letzten zehn Jahren wurden mehrere Tests erfolgreich von bakterieller Biofilm Studien zur Hefe Forschung, wie MAT Bildung Assays zur Kolonie verteilt auf weichem Agar und Kristallviolettfärbung quantitativ zu messen Zelloberfläche Einhaltung getroffene Maßnahme. 12, 21 Allerdings gab es einige Verwirrung in Assays entwickelt, um qualitativ bewerten die Klebstoff-und invasive Phänotypen der Hefe in Agar. Hier präsentieren wir eine einfache und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Klebstoff-und invasive Qualität der Hefestämme mit leicht verständlichen Schritten, um die Haftung Beurteilung der Invasion Beurteilung zu isolieren. Unsere Methode, aus früheren Studien, 10, 16 angenommen beinhaltet wachsenden Zellen in flüssigen Medien und Plattierung auf Differential Nährstoff Bedingungen für das Wachstum von großen Flecken, die wir dann mit Wasser zu waschen, um die Haftung zu beurteilen und reiben Zellen vollständig von der Agar-Oberfläche zur Invasion in beurteilen Agar. Wir beseitigen die Notwendigkeit für Schlieren Zellen auf Agar, der die Invasion von Zellen wirkt sich in den Agar. In der Regel beobachteten wir, dass haploide Stämme, die Agar-Invasion immer Kleber, aber nicht alle Kleber Stämme können Agarmedium einzudringen. Unser Ansatz kann in Verbindung mit anderen Assays verwendet werden, um sorgfältig zu sezieren die Differenzierung Schritte und Anforderungen der Hefe Signaltransduktion, Differenzierung, Quorum Sensing und Biofilmbildung.

Protocol

  1. Legen Sie 200 &mgr; l der wachsenden Kulturen von Interesse auf synthetischen Medien Platten mit den erforderlichen Hunger Bedingungen (SC mit 2% Glucose im Vergleich zu SC mit 0,2% Glucose, zum Beispiel) Wenn die Dichte der Kulturen zu verschieden von einander sind, passen Zellzahl pro 200 &mgr; l Kultur so dass jeder Tropfen hat etwa die gleiche Anzahl von Zellen.
  2. Vergewissern Sie sich, Aufzeichnungen über die Drop auf den Platten, die Kultur ist zu halten.
  3. Halten Sie die Platte Deckel angelehnt und entweder bei Raumtemperatur oder bei 30 ° C bis Tropfen trocken sind.
  4. Seal-Platten mit Parafilm und Plastikfolie (optional) und in 30 ° C für 3-7 Tage zu verlassen.
  5. Document das Wachstum von Zellen auf Platten (durch Scannen, wobei ein digitales Bild, etc)
  6. Wash-Zellen aus der Agar-Oberfläche mit hohem Druck Wasser (vorzugsweise VE-Wasser) für etwa eine Minute unter Betreuung der Agar nicht zu heben und die Ausrichtung ändern.
  7. Befreien Sie sich von überschüssigem Wasser, indem Platten auf Küchenpapier und lassen sie offen, um zu trocknen.
  8. Sobald die Platten trocken Dokument Haftung auf jeder Platte (durch Scannen oder das Fotografieren)
  9. Mit einem behandschuhten Finger sanft abreiben Zellen bilden die Agar-Oberfläche unter fließendem Wasser für etwa eine Minute.
  10. Trocknen Sie die Platten wie zuvor.
  11. Wenn Sie ein Binokular, entfernen Sie die Nadel, bevor Platten auf den Mikroskop-Plattform.
  12. Document Invasion mit 10x oder 40x Vergrößerung. Vergewissern Sie sich auf den mittleren Teil jedes Kreises zu konzentrieren, für die Kanten zu voll wird es sein, einzelne Zellmorphologien sehen. Die Kanten können wird der Grad der filamentösen Wachstum und kann zum späteren Nachschlagen dokumentiert werden. Scannen oder unter ein digitales Foto von der gesamten Platte kann auch hilfreich sein.

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Discussion

Hefezellen zeigen verschiedene Modi Differenzierung nach Verfügbarkeit von Nährstoffen und ökologischen Bedingungen, einschließlich Sporenbildung unter Hunger und Stress-Bedingungen, Filamentierung unter verschiedenen Nährstoffen betont, und Flockung. Verschiedene Hefen, einschließlich S. cerevisiae und C. albicans, kann auch in Biofilmen durch eine vielfältige Reihe von Mikroorganismen gebildet gefunden werden. Zwar gibt es eine gewisse Korrelation mit Filamentierung und invasive Verhalten, es ist nicht klar, wie Filamentierung könnte Invasion und Besiedlung von Oberflächen und Gewebe verursachen. Hefe kann sicherlich in beiden vegetative und filamentösen Formen in Biofilmen in der Natur sowie Orte, an denen sie die menschliche Gesundheit gefährden, wie Katheter und infizierten menschlichen Organen gefunden werden. 10-13 in, um die Signalwege durch Hefen genutzt werden, um Tiere zu infizieren und in schädlichen und nützlichen Biofilmen teilnehmen zu verstehen, müssen wir zugängliche und zuverlässige Tests. Hier haben wir einen Test, aus bereits bestehenden Adhäsion und Invasion Assays für Hefe verabschiedet, mit dem wir qualitativ die Klebstoff-und invasive Phänotypen der Hefe-Stämme und Mutanten unter verschiedenen Bedingungen erlauben entwickelt. Der Test hier vorgestellten beseitigt die Anforderung für Schlieren Hefezellen auf den Agar, wo die bloße Wirkung der Streifen der Agar-Oberfläche ändert sich die invasive und Hafteigenschaften von Hefe. Digitale Abbildung der vor allem die eindringenden Zellen durch ein Mikroskop ermöglicht semi-quantitative Beurteilung des Grades der Invasion und Adhäsion. Solche Nachweis des invasiven und Klebstoff-Zellen ist kostenlos die einzelne Zelle Agar Invasion Assay entwickelt von der Sprague Labor 9 und lässt sich an zeitlichen Verlauf Experimenten zu tun.

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Acknowledgements

Wir möchten Lisa Schneper und Katrin Duevel für ihre Einsichten danken bei der Entwicklung dieses Tests.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Moticam 350 Camera Motic discontinued (new model: Moticam 352) A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac.

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References

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