S. cerevisiaeの接着と寒天の侵略のためのアッセイ

Biology

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Summary

我々は、侵襲と偽菌糸分化の尺度としての酵母の付着と寒天の侵略のための定性分析について説明します。この簡単なアッセイは、様々な変異体と同様に酵母の分化への影響、環境手がかりとシグナル伝達経路の侵襲的な表現型を評価するために使用することができます。

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Guldal, C. G., Broach, J. Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae. J. Vis. Exp. (1), e64, doi:10.3791/64 (2006).

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Abstract

酵母は、多くの微生物が表面に定着する自然なバイオフィルム、に記載されています。このような人工物の表面などの人工環境では、バイオフィルムは、工業的生産性を減らす構造を破壊し、人間の生命を脅かすことができる。一方、1-3、活用するバイオフィルムの力は、環境をきれいにし、持続可能なエネルギーを生成することができます。表面を植民地化し、複雑なバイオフィルムに参加するS. cerevisiaeの4月8日能力は、主にこの生体内の様々なシグナル伝達経路と環境手がかりによって引き起こされる分化のプログラムの再発見まで、無視されました。 9,10迅速バイオフィルムの接合には、S.セレビシエを置くなどのRas - PKA、Kss1 MAPK、およびHog1浸透経路などのシグナル伝達経路の相互作用と収束を理解するためにモデル生物として出芽酵母を使用しての継続的な関心​​、生物学およびシグナル伝達の研究。この目的のために11-20、長い間、接着剤、偽菌糸フィラメントへの酵母細胞の分化は、様々な環境の変化に応じてシグナル伝達経路の活性化のための便利な読み出しとなった。しかし、フィラメンテーションは、それが誤解を招くようなシンプルな表現型であるかのようにそれのためにアッセイすることができます表現型の複雑な集合体です。過去十年間で、いくつかのアッセイが正常にそのような定量的に細胞表面の付着を測定するために軟寒天とクリスタルバイオレット染色でコロニーの広がりを測定するためにMATの形成アッセイのような酵母の研究、に細菌バイオフィルムの研究から採用された。 12、21しかし、定性的に寒天で酵母の接着剤と侵襲的表現型を評価するために開発されたアッセイでいくつかの混乱があった。ここで、我々は、侵略の評価から、粘着力評価を分離するための手順を理解しやすいと酵母株の接着剤と侵襲的な品質を評価するためのシンプルで信頼性の高い方法を提示する。これまでの研究、10、16から採用された我々の手法は、我々はその後の接着性を評価するために水で洗って浸潤を評価するために寒天表面から細胞を完全にこすり大スポット、の成長のための差動栄養条件で液体培地とメッキで成長する細胞を含む寒天。我々は、寒天に細胞の浸潤に影響を及ぼす寒天の上に細胞をストリーキングの必要性を、排除する。一般的に、我々は寒天を侵略半数体株は、常に接着剤である、まだすべての接着剤の株は寒天培地に侵入できることを観察した。我々のアプローチは慎重に酵母のシグナル伝達、分化、クオラムセンシング、及びバイオフィルム形成の分化の手順と要件を分析する他のアッセイと組み合わせて使用​​することができます。

Protocol

  1. 文化の密度が互いにあまりに異なる場合は、必要な飢餓の条件(0.2%グルコースを含むSC対2%グルコースとSC、たとえば)を持つ合成培地プレート上での関心の高まり文化の200ulを入れ、200ulの培養液あたりのセル数を調整するので、それぞれのドロップはほぼ細胞の同じ量を持っています。
  2. プレート上にドロップが文化になっている記録を保持することを確認してください。
  3. プレートの蓋を半開きにしておき、滴が乾燥しているまで、室温または30℃のどちらか残す。
  4. シールのパラフィルムとプラスチックラップ(オプション)プレートとは3-7日のために30℃にしておきます。
  5. (デジタル写真、などを考慮、走査することにより)プレート上の細胞の成長を文書化
  6. 方向を持ち上げると、変更しないように寒天のために注意しながら約分間、高圧の水(できれば純水)を寒天表面から細胞を洗い流してください。
  7. ペーパータオルにプレートをタップし、乾燥して開き、それらを残して余分な水分を取り除く。
  8. プレートは、各プレート上で乾燥した文書の密着性 (デジタル写真をスキャンしたり、服用によって)されると
  9. 手袋をはめた指で、そっとこすり細胞は約1分間、流水で寒天表面を形成する。
  10. 以前のようにプレートを乾燥させる。
  11. 解剖スコープを使用する場合、顕微鏡のプラットフォームの上にプレートを配置する前に針を取り除く。
  12. 10倍または40倍の倍率でドキュメントの侵略 。エッジはあまりにも個々の細胞の形態を見るために混雑するため、それぞれの円の中央部分に集中することを確認してください。エッジは、糸状成長のレベルを示すことができますし、将来の参考のために文書化することができます。スキャンまたはプレート全体のデジタル写真を撮ることも役立ちます。

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Discussion

酵母細胞は、飢餓やストレスの状況、様々な栄養ストレス下のフィラメンテーション、および凝集の下で胞子形成を含む、栄養状況や環境条件に応じて様々な差別化モードを、表示します。 S. cerevisiaeとC.アルビカンスを含む様々な酵母は、、また、微生物の多様な集合によって形成されたバイオフィルムに記載されています。フィラメンテーションおよび侵入行動と何らかの相関関係があるけれども、それはフィラメントが表面と組織への浸潤と植民地化を引き起こす可能性が正確にどのように明らかではない。酵母は、確かにそのようなカテーテルと感染した人間の臓器などの植物や糸状自然の中でバイオフィルムのフォームだけでなく、彼らが人間の健康を脅かすところ、両方で見つけることができます。 10月13日の動物に感染すると有害と有益なバイオフィルムに参加するために酵母によって利用されるシグナル伝達経路を理解するために、我々はアクセス可能で信頼性の高いアッセイを開発する必要があります。ここでは、すでに既存の密着性と私たちは質的に様々な条件で酵母菌株および変異体の接着剤と侵襲的表現型を決定できるように酵母で使用可能な浸潤アッセイ、から採用、アッセイを開発した。ここで紹介するアッセイは、寒天の表面をストリ​​ーキングの単なるアクションは酵母の侵襲性と接着特性を変更する寒天、上に酵母細胞をストリーキングする必要がなくなりました。顕微鏡で特に浸潤細胞のデジタル画像は、侵略と密着度の半定量的評価が可能になります。浸潤と接着細胞のような検出は、無料の単一細胞の寒天の浸潤アッセイのSpragueラボ9で開発し、タイムコース実験を行うために適合させることができるです。

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Acknowledgements

我々は、このアッセイの開発に彼らの洞察力のためにリサSchneperとカトリンDuevelに感謝します。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Moticam 350 Camera Motic discontinued (new model: Moticam 352) A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac.

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References

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