从海兔的神经细胞培养的高分辨率成像生长锥

Published 2/20/2008
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Biology

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Summary

海兔californica神经元发展大文化的生长锥,生长锥的运动和指导的高分辨率成像的优秀。在这里,我们提出了一种海兔袋细胞神经元的剥离和电镀以及设立一个活细胞成像室的协议。

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Lee, A. C., Decourt, B., Suter, D. M. Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones. J. Vis. Exp. (12), e662, doi:10.3791/662 (2008).

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Abstract

神经生长锥的轴突,可以检测到环境中的指导线索,并传导到对相应的靶细胞的定向运动信息提示的高度能动结构。要充分了解信息,指导如何从细胞表面传输到底层的动态骨架网络,需要适合高时空分辨率的成像在活细胞的蛋白质动力学模型系统。典型的脊椎动物生长锥是太小了定量分析的F -肌动蛋白和微管动力学。从海兔海兔californica的神经元是脊椎动物的神经元的5-10倍,比大,可以很容易地在室温下保持的,是非常强大的细胞显微和生物物理测量。他们的生长锥有非常明确的细胞质地区和一个很好的描述的骨架系统。显微注射神经细胞机构可以与各种研究生长锥的运动和指导的探头。在本议定书中,我们展示了一个过程,解剖腹腔神经节,培养袋细胞神经元,并设立一个生长锥的活细胞成像的成像室。

Protocol

解决方案

  • L15 - ASW的细胞培养液(1L)
    • L15粉1袋
    • 加入800毫升的H 2 O超纯
    • 氯化钠400毫米
    • 硫酸镁4 27毫米
    • MgCl 2的 28毫米
    • L -谷氨酰胺4毫米
    • 庆大霉素50微克/毫升
    • HEPES 5毫米
    • 调整pH值7.9
    • 添加一滴一滴氯化钙2 9.3毫米(停止,如果沉淀物)
    • 加入H 2 O超纯水至1 L
    • 检查渗透压与渗压计(蒸气压力,Wescor#5520)(950-1000毫摩尔/公斤)
    • 过滤器采用0.22微米正压过滤装置(过滤器:微孔SVGV010RS)
    • 在4 ° C存储长达1个月
  • 聚- L -赖氨酸(70-150 KD)200微克/毫升的无菌H 2 O超纯原液保存在-20℃
  • 0.5 M MgCl 2的解决方案

第1天:海兔的腹神经节的解剖

制备的酶解解决方案

  1. Eppendorf管中,称取9-10毫克Dispase酶(沃辛顿,猫:LS02111)
  2. L15及反潜培养基,添加900μL和100μL无菌H 2 O超纯
  3. 混合并放置在室温(RT)

腹神经节的解剖

  1. 填写50毫升的注射器,用0.5 M MgCl 2的解决方案。
  2. 坦克从一个动物,轻轻地处理,以避免动物的墨防御反应。
  3. 在夹层板在其一侧的海兔(聚苯乙烯泡沫板),喙侧的权利,尾椎的一面放置到左边。
  4. 针插入动物仅次于头部和体腔注入所有MgCl 2的解决方案。
  5. 轻轻揉搓动物驱散MgCl 2的解决方案,整个体腔,等待几分钟动物完全麻醉。
  6. 引脚的动物的头部和尾部的夹层板与两针。
  7. 使用镊子,解除皮肤,通过对头部和尾部的大剪刀的皮肤和肌肉层切开,使上侧的大开放。
  8. 查找毛刷状卵巢下腹部神经节。使用镊子举行约1厘米在前面的腹神经节的连接神经,降低清扫剪刀钳控股地位的前面和后面的腹神经节神经。
  9. Dispase解决方案,在22孵育15-16 h的神经节放入℃使用温度控制水浴。

第2天:海兔袋细胞电镀

准备多聚赖氨酸涂层盖玻片

  1. 在流台,准备3个35毫米培养皿中的神经节清扫工作的美味佳肴,灌装4毫升L15及反潜中等每个。腹神经节从dispase解决方案转移工作15.5小时消化后的菜肴之一。
  2. 使用钳取酸清洗#1.5盖玻片(22x22毫米)乙醇中,除去酒精和消毒本生灯燃烧超过他们简要盖玻片。让他们简单地冷却,然后放入培养皿中的盖玻片。
  3. 准备一个黄色的提示在本生灯(火焰只是简单地避免塑料熔化!)弯曲弯曲的镀尖。
  4. 准备适量的20微克/毫升的多聚赖氨酸的解决方案,200微克/ 毫升 ,用无菌H 2 O超纯原液稀释。
  5. 每个盖玻片覆盖500μL的20μg/ ml的多聚赖氨酸和20分钟在室温下孵育。
  6. 与500μL无菌H 2 Ø超纯每个洗盖玻片每3-5倍。
  7. 从盖玻片取出的水;填写L15及反潜培养液4毫升每道菜。

离解袋细胞

  1. 一个夹层显微镜下,削减一半使用的清扫剪刀和以前用95%乙醇(图1 1号线)清洗钳腹神经节。
  2. 在切袋细胞集群和hemiganglion细胞(图1,2号线)之间的神经节,并切去袋细胞的另一边的剩余的神经扩展(图1,第3行)的一半。一节半时间的工作,留在盘的另一半,而从第一个群集细胞都被镀。
  3. 利用两个钳(或一个钳和清扫剪刀),释放袋推开袋细胞群周围的结缔组织鞘细胞群。清扫剪刀剪去结缔组织,如果需要的话。小心不要挤在这个过程中太多触摸袋细胞群。
  4. 当大多数的结缔组织被删除,转移的BAG细胞群集准备工作进入一个新盘的弯曲的黄色提示。要小心,不要让袋细胞群被困在里面的黄色提示或滞留在空气/介质界面。
  5. 磨碎的黄色的提示,删除单个袋细胞群。吸取集群和针尖。开始与低剪切力,需要增加力量。始终使用最低的力量,需要删除没有过多的脑细胞死亡的神经元。
  6. 收集了3-5健康袋细胞,并与多聚赖氨酸涂层的盖玻片,他们转移到菜。避免拿起死细胞(黑色/透明的中心)和结缔组织碎片。
  7. 重复步骤6。 15-25活神经元的每个盖玻片中心举行。如果死细胞或碎片,以及转移,删除不需要的材料,拿起它,或从健康细胞中,它吹。这个过程需要两个集群约为2-3小时。
  8. 一旦完成,流的长椅上的培养皿保持在室温下至少2小时,让细胞附着(保持流板凳鼓风机关闭,以避免不必要的振动)。
  9. 在14 ° C过夜,或直至进一步使用,放入孵化器的菜肴。生长锥可能会在4-10小时。

图1。海兔californica腹神经节的示意图。颜色的线条表示削减获得袋细胞簇。
图1。 海兔californica腹神经节的示意图。颜色的线条表示削减获得袋细胞簇。

第3天:海兔袋细胞实时成像室

大会的成像室

  1. 使用包活细胞成像实验细胞之前,低功耗显微镜检查细胞。如果细胞还没有开发的健康生长锥,在室温下供应新鲜培养基和休假1-2个小时。
  2. 供应新鲜L15及反潜介质板,真空线删除旧媒体(〜2毫升)的一半,并加入2 ml新的L15 - ASW的每培养皿中的介质。重要的是不完全删除所有媒体从盘一次,因为这将消除细胞的盖玻片。
  3. 袋细胞成像,我们聚集在两个盖玻片和两个塑胶垫片,类似于三明治的成像室。夹心顶部盖玻片被切断短允许容易的培养基和试剂交流。在装配过程中,与袋的贴壁细胞的盖玻片应被淹没在任何时候,以防止其移动细胞L15及反潜培养基。
  4. 准备室,切断〜#1盖玻片22x22毫米钻石笔(玻璃切割机)和标尺的右侧2毫米。
  5. 用1 ml注射器,适用于高真空润滑脂较短盖玻片两侧,并连接每边的塑胶垫片。应用真空润滑脂两个垫片。
  6. 反转盖玻片和间隔大会,并将其放置到培养皿包含一个玻璃罩上碟袋细胞。对齐并轻轻向下按压顶部底部的盖玻片盖玻片坚持两个Q - TIPS反向。
  7. 使用镊子,轻轻夹心大会的培养皿中无泄漏出来的媒介。对齐两个盖玻片,如果需要的话,一个Kimwipe擦去多余的介质。放置到显微镜幻灯片持有人的底部夹层和附加使用剪辑的护理外壳。
  8. 清洁三明治的顶面中心与Q - TIPS擦了擦玻璃清洁剂(旌宇玻璃清洁剂)。第二,干棉条的玻璃清洁,以避免连败线快速干燥。底部的盖玻片相同。免费清洁盖玻片连胜线是重要的高品质的影像。

袋细胞在显微镜

由于海兔袋细胞神经元文化的密度低,这是最好的,如果您的显微镜设置阶段的定位功能,促进细胞之间的的切换。袋细胞可以很容易地保存在舞台上的几个小时在成像实验在室温下。定期交换的媒介,以避免蒸发。

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Discussion

海兔袋细胞神经元提供了很少的非神经元细胞的无血清神经元细胞培养系统。这些神经元生长锥形成非常大的,适合解决一些重要的细胞生物学问题。袋细胞神经元可以很容易地被操纵,并在室温下成像几个小时。使用荧光斑点显微镜(密克罗尼西亚),可以定量分析的F -肌动蛋白和微管聚合和易位动态的各种参数。这些成像工具,与最近发布的海兔的基因组信息,以及改进的表达技术,使这些神经元的一个功能强大的模型系统,为研究神经生长锥的蠕动和指导的分子和细胞机制。

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Acknowledgements

我们想感谢我们的程序和罗德尼McPhail(生物科学系,美国普渡大学)寻求协助拍摄与编辑夹层视频瑞安Maneri(Oystercatcher制作,LLC)。在苏特尔实验室的研究是支持由美国国立卫生研究院(R01 NS049233)和Bindley生物科学中心,在美国普渡大学的资助到DMS

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
#1 glass coverslips 22x22 mm Tool VWR international 48366067
#1.5 glass coverslips 22x22 mm Tool Corning 2870-22
35 mm Petri dishes Tool Falcon BD 353001
Filters for medium filtration Tool EMD Millipore SVGV010RS
High vacuum grease Tool Dow Corning 1597418
Osmometer Tool Wescor 5520
Plastic shims Tool Small Parts, Inc. SHSP-200
Calcium chloride Reagent Fisher Scientific C79-500
Gentamicin Reagent Invitrogen 15750-060
HEPES Reagent Sigma-Aldrich H4030
L15 medium Reagent Invitrogen 41300-039
L-glutamine Reagent Sigma-Aldrich G8540
Magnesium chloride Reagent Mallinckrodt Baker Inc. 5958-04
Magnesium sulfate Reagent Mallinckrodt Baker Inc. 6070-12
Poly-L-lysine (70-150 kD) Reagent Sigma-Aldrich P6282
Sodium chloride Reagent Mallinckrodt Baker Inc. 7581
Neutral Protease (Dispase) Reagent Worthington Biochemical LS02111

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References

  1. Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
  2. Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
  3. Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
  4. Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).

Comments

4 Comments

  1. to the Suter lab,  Excellent video protocol!Can you provide more detailed information on the signal transduction pathways you looked at in the Aplysia model using the RBI assay? Thank you!Daniel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2008 - 7:58 PM
  2. Dear Daniel, Thank you for your comment. We have studied the role of Src tyrosine kinases in apCAM-mediated growth cone steering using the RBI assay (Suter and Forscher, ²001; Suter et al., ²004). Daniel Suter 

    Reply
    Posted by: Daniel S.
    March 13, 2008 - 9:35 AM
  3. Can you please provide me with a list of neuronal cell lines from Aplysia that can be used for memory related studies

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 21, 2009 - 11:40 PM
  4. Hi Shilpa,

    As far as I know there are no Aplysia neuronal cell lines available. In vitro studies in this system are done with primary neuronal cell cultures.

    Daniel Suter

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 22, 2009 - 3:17 PM

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