成長円錐の高分解能イメージングのためのアメフラシから神経細胞の培養

Published 2/20/2008
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Biology

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Summary

アメフラシカリフォルニのニューロンは、成長円錐の運動性と指導の高分解能イメージングのための優れている文化の中で大きな成長円錐を開発する。ここでは、アメフラシの袋の細胞ニューロンの解剖やメッキ用だけでなく、生細胞イメージングのためのチャンバーを設定するためのプロトコルを提示する。

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Lee, A. C., Decourt, B., Suter, D. M. Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones. J. Vis. Exp. (12), e662, doi:10.3791/662 (2008).

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Abstract

神経成長円錐は、環境で指導の手がかりを検出し、適切な標的細胞に向けて方向性に、この情報を伝達することができる軸索の先端に非常に運動性構造です。完全なガイダンス情報が細胞表面から基盤となる動的な細胞骨格ネットワークに送信する方法を理解するためには、高い時間および空間分解能でのタンパク質の動態の生細胞イメージングに適したモデル系が必要です。典型的な脊椎動物の成長円錐は、定量的にF -アクチンと微小管のダイナミクスを分析するには小さすぎます。アメフラシアメフラシカリフォルニから神経細胞は、脊椎動物の神経細胞よりも5〜10倍も大きいです簡単に室温に保つことができるとマイクロマニピュレーションと生物物理学的測定のための非常に堅牢な細胞である。彼らの成長円錐は、非常に細胞質領域とも上述の細胞骨格系を定義している。神経細胞体は、成長円錐の運動性と指導を​​研究するためのプローブの様々なマイクロインジェクションすることができます。現在のプロトコルでは、腹部神経節の郭清のための手順を示す袋の細胞の神経細胞の培養と成長円錐の生細胞イメージングのためのイメージングチャンバーを設定。

Protocol

ソリューション

  • L15 - ASWの細胞培養培地(1リットル)
    • L15粉末1袋
    • H 2 O超純800mlを追加する
    • NaClを400mMの
    • し、MgSO 4 27 mMの
    • のMgCl 2 28 mMの
    • L -グルタミン4 mMの
    • ゲンタマイシン50μg/ mlの
    • HEPES 5mMの
    • pHを7.9に調整する
    • ドロップのCaCl 2 9.3 mMの(沈殿物と停止する)ことで、ドロップを追加します。
    • 1リットルにH 2 Oの超高純度を追加
    • 浸透圧計で浸透圧(950-1000ミリモル/ kg)を確認してください(蒸気圧、Wescor#5520)
    • 正圧ろ過ユニット(:ミリポアのSVGV010RSフィルタ)を用いて0.22μmのフィルター
    • 最大1ヶ月、4℃で保存する
  • ポリ- L -リジン(70から150 kD)の滅菌H 2 O超純で200μg/ mlのストック溶液は-20 ° Cの保管
  • 0.5 M MgCl 2溶液

1日目:アメフラシ腹部神経節の解剖

酵素的解離溶液の調製

  1. エッペンドルフチュー​​ブに:ディスパーゼ酵素(LS02111ワーシントン、猫)の90〜10 mgを量り
  2. L15 - ASWの培養液900μlを加え、そして滅菌H 2 O超純100μlの
  3. 室温で混合し、場所(RT)

腹部神経節の解剖

  1. 0.5 MのMgCl 2溶液と50 mlの注射器を埋める。
  2. タンクから一匹を取る、動物のインクの防御反応を避けるために、優しく扱う。
  3. 右から左に、尾側に解剖基板の側にアメフラシ (発泡スチロールボード)、吻側側に置きます。
  4. ちょうど頭の後ろに動物に針を挿入し、体腔内にすべてのMgCl 2溶液を注入する。
  5. ゆっくりと体の空洞を通してMgCl 2溶液を分散させるために動物をこすり、完全に麻酔になる動物の数分間待つ。
  6. 2本の針で解剖ボードに動物の頭と尾をピン。
  7. 側に大きな開口部を作るために頭と尾に向かって大きなハサミで皮膚と筋肉の層を切って、皮膚を​​持ち上げるために鉗子を使用してください。
  8. ブラシ状卵巣下の腹部神経節を見つける。腹部神経節の前に約1cmの接続の神経を保持するための鉗子を使用して、鉗子保持位置の前で、腹部神経節の後ろに解剖はさみで神経を切断。
  9. 22℃15〜16時間ディスパーゼソリューションとインキュベートへの場所の神経節℃の温度制御水浴を使用して。

2日目:アメフラシの袋細胞のめっき

ポリ-リジンでコーティングされたカバースリップの準備

  1. フローベンチでは、4ミリリットルL15 - ASW媒体それぞれで埋める、神経節の解剖の作業皿として3 35ミリメートルのペトリ皿を準備する。ディスパーゼ溶液から消化の15.5時間後に働く料理の一つに腹部神経節を転送する。
  2. 鉗子を使用すると、エタノールで保存されている#1.5カバースリップ(22x22 mm)を酸洗浄を行う、アルコールを削除し、ブンゼンのバーナーを介して簡単にそれらを燃えることによってカバースリップを滅菌する。培養皿にカバースリップを配置する前にそれらを簡潔に冷ます。
  3. ブンゼンバーナー(短時間だけ火炎プラスチックの溶融を回避するために!)に黄色の先端を曲げることにより湾曲したメッキの先端を準備。
  4. 滅菌H 2 O超純で200μg/ mlのストック溶液を希釈し、20μg/ mlのポリ-リジン溶液の適当量を準備します。
  5. 20μg/ mlのポリ-リジン、室温で20分間インキュベートの500μlと各カバースリップをカバー。
  6. 500μlの滅菌H 2 O超純ごとに各カバースリップ3-5回洗浄する。
  7. カバーグラスから水を取り除く。L15 - ASW培地4mlで各皿を埋める。

袋の細胞の解離

  1. 解剖顕微鏡下で、予め95%エタノール(図1ライン1)で洗浄half使用して解剖ハサミとピンセットで腹部神経節をカット。
  2. 神経節の半分で、袋の細胞のクラスターとhemiganglion細胞(図1ライン、2)との間で切断し、袋の細胞(図1 3行目)の反対側の残りの神経の拡張子を切り取る。一度に神経節の半分で動作する、最初のクラスタからの細胞が播種されている間に皿に残りの半分を残す。
  3. two鉗子を(または1つの鉗子と解剖鋏)を使用して、袋のセルのクラスタを囲む結合組織鞘を脇にプッシュすることでバッグの細胞クラスターを離します。必要に応じて解剖用鋏と結合組織を切り取る。このプロセスの間にあまりにも多くのバッグの細胞クラスターを圧迫し、触れないように注意してください。
  4. ほとんどの結合組織のが削除されるとき、bを転送以前の準備曲がった黄色の先端を使用して新しい作業皿にAGの細胞クラスター。袋のセルのクラスタが黄色の先端内に閉じ込めたり、空気/媒質界面で立ち往生するように注意してください。
  5. 個々の袋の細胞を除去するために黄色の先端を使用してクラスタをひいて粉にする。先端のうちにクラスタをピペッティングすることによって行います。低せん断力から始め、必要に応じて力を増加させる。あまりにも多くの細胞を殺すことなく、神経細胞を除去するために必要な最小の力を常に使用します。
  6. 3月5日健康な袋の細胞を収集し、ポリリジンコートしたカバースリップで皿に移す。死細胞(彼らは中央の黒/透明な)と結合組織の破片を拾うことは避けてください。
  7. 手順6を繰り返します。とそれぞれのカバーの中央に約15-25のライブニューロンを配置。死んだ細胞や破片も同様に転送される場合、それを拾ったり、健康な細胞から、それを吹き飛ばすことによって不要な物質を取り除く。このプロセスは、両方のクラスタのために約2-3時間かかります。
  8. 一度(不要な振動を避けるために、送風機、フローベンチをオフにしておく)細胞がアタッチできるように室温で少なくとも2時間の流れのベンチ上で培養皿を保つ終えた。
  9. 14℃で一晩、またはさらに使用するまでインキュベーターに皿を置きます。成長円錐は、40〜10時間で開発することがあります。

図1。アメフラシカリフォルニ腹部神経節の概略図。袋のセルクラスタを入手するために切る場所の色の線が示している。
図1。 アメフラシカリフォルニ腹部神経節の概略図。袋のセルクラスタを入手するために切る場所の色の線が示している。

3日目:アメフラシの袋の細胞のライブイメージングのためのチャンバーを設定する

イメージングチャンバーの組立

  1. ライブセルイメージングの実験のために袋の細胞を使用する前に、低消費電力の顕微鏡で細胞を検査する。細胞が健全な成長円錐を開発していない場合は、新鮮な培地を供給し、1〜2時間室温で残す。
  2. 新鮮L15 - ASW培地でプレートを供給するため、真空ラインで古い培地の半分(〜2ミリリットル)を削除し、ペトリ皿あたりの新しいL15 - ASW培地2 mlを加える。これはカバースリップからセルを削除するので、完全に、すべてを一度に皿からすべてのメディアを削除しないことが重要です。
  3. 袋のセルイメージングのために、我々は2つ​​のカバースリップとイメージングチャンバーのようなサンドイッチの2つのプラスチック製スペーサを組み立てます。サンドイッチのトップカバースリップは、培地および試薬の交換が簡単にできるように短くカットされます。組み立て中に、接続されている袋の細胞とカバーガラスを外れから細胞を防止するために常にL15 - ASWの培地に浸漬する必要があります。
  4. 室を準備するには、カットオフ〜2mmのダイヤモンドペン(ガラスカッター)と定規で第1位カバースリップ22x22 mmの右側から。
  5. 1 mlのシリンジを使用して、短いカバーの両側に高真空グリースを適用し、それぞれの側にプラスチック製スペーサを取り付けます。両方スペーサーの上部に真空グリースを塗布してください。
  6. カバーガラスの袋の細胞を含むペトリ皿にカバーガラスとスペーサーの組み立て、および場所を反転させる。合わせ、ゆっくりと二つのQ -チップの逆の端と底部カバーに上部カバースリップスティックを押し下げ。
  7. 鉗子を使用して、静かに漏れる媒体なしペトリ皿のサンドイッチアセンブリを持ち上げます。必要に応じて、二つのカバーグラスを合わせ、キムワイプで余分な培地を拭き取ってください。顕微鏡のスライドホルダーの底部分の上にサンドイッチを置き、クリップを使って慎重にカバーを取り付けます。
  8. Q -チップとサンドイッチの上面の中央をきれいにガラスクリーナー(スパークルは、ガラスクリーナーとして使用されている)でdabbed。すぐにストリーク線を避けるために2番目、乾いた綿棒でガラスクリーナーをふいて乾かす。ボトムカバースリップについても同じ操作を行います。ストリークラインの清浄なカバーガラスは、高品質の画像処理のために重要である。

顕微鏡での袋の細胞

アメフラシの袋の細胞ニューロン培養は、低密度であるのであなたの顕微鏡のセットアップは、細胞間の切り替え容易にするために、ステージの位置決め機能を持っている場合、それが最善です。袋の細胞は容易にイメージング実験中にステージ上で数時間室温に保つことができる。蒸発を防ぐために定期的に培地を交換する。

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Discussion

アメフラシの袋セルのニューロンは非常に少数の非神経細胞に血清を含まない神経細胞培養系を提供しています。これらのニューロンは、重要な細胞生物学的な質問の数に対応するために適切な非常に大きな成長円錐を形成します。袋のセルのニューロンは、簡単に数時間かけて室温で操作して撮像することができます。蛍光を使用することで、1つは、定量的にF -アクチンと微小管の重合と転座のダイナミクスのさまざまなパラメータを分析することができます顕微鏡(FSM)のスペック。最近リリースされたアメフラシゲノムの情報だけでなく、改善された表現手法と一緒にこれらのイメージングツールは、神経細胞成長円錐の運動性と指導の分子細胞メカニズムを研究するためにこれらのニューロンは、強力なモデルシステムを作る。

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Acknowledgements

我々は、解剖のビデオを編集すると援助のために私たちの手順とロドニーマクフェイル(生物科学科、パデュー大学)の撮影にライアンManeri(ミヤコドリプロダクション、LLC)に感謝したいと思います。スーターのラボでの研究は、パデュー大学のNIH(R01 NS049233)とBindleyバイオサイエンスセンターからDMSへの補助金によってサポートされています

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
#1 glass coverslips 22x22 mm Tool VWR international 48366067
#1.5 glass coverslips 22x22 mm Tool Corning 2870-22
35 mm Petri dishes Tool Falcon BD 353001
Filters for medium filtration Tool EMD Millipore SVGV010RS
High vacuum grease Tool Dow Corning 1597418
Osmometer Tool Wescor 5520
Plastic shims Tool Small Parts, Inc. SHSP-200
Calcium chloride Reagent Fisher Scientific C79-500
Gentamicin Reagent Invitrogen 15750-060
HEPES Reagent Sigma-Aldrich H4030
L15 medium Reagent Invitrogen 41300-039
L-glutamine Reagent Sigma-Aldrich G8540
Magnesium chloride Reagent Mallinckrodt Baker Inc. 5958-04
Magnesium sulfate Reagent Mallinckrodt Baker Inc. 6070-12
Poly-L-lysine (70-150 kD) Reagent Sigma-Aldrich P6282
Sodium chloride Reagent Mallinckrodt Baker Inc. 7581
Neutral Protease (Dispase) Reagent Worthington Biochemical LS02111

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References

  1. Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
  2. Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
  3. Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
  4. Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).

Comments

4 Comments

  1. to the Suter lab,  Excellent video protocol!Can you provide more detailed information on the signal transduction pathways you looked at in the Aplysia model using the RBI assay? Thank you!Daniel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2008 - 7:58 PM
  2. Dear Daniel, Thank you for your comment. We have studied the role of Src tyrosine kinases in apCAM-mediated growth cone steering using the RBI assay (Suter and Forscher, ²001; Suter et al., ²004). Daniel Suter 

    Reply
    Posted by: Daniel S.
    March 13, 2008 - 9:35 AM
  3. Can you please provide me with a list of neuronal cell lines from Aplysia that can be used for memory related studies

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 21, 2009 - 11:40 PM
  4. Hi Shilpa,

    As far as I know there are no Aplysia neuronal cell lines available. In vitro studies in this system are done with primary neuronal cell cultures.

    Daniel Suter

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 22, 2009 - 3:17 PM

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