Büyüme Konileri Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için Aplysia Nöronal Hücre Kültürleri

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Aplysia californica nöronların büyüme konisinin motilite ve rehberlik yüksek çözünürlüklü görüntüleme için mükemmel bir büyük kültür büyüme konileri gelişir. Burada, diseksiyon ve Aplysia çanta hücresi nöronların kaplama gibi canlı hücre görüntüleme için bir oda kurmak için bir protokol mevcut.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, A. C., Decourt, B., Suter, D. M. Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones. J. Vis. Exp. (12), e662, doi:10.3791/662 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nöronal büyüme konileri, ortamda, rehberlik ipuçları tespit ve uygun hedef hücre doğru yönlü hareket içine bu bilgileri transduce akson ucunda son derece hareketli yapılardır. Rehberlik bilgileri tam olarak hücre yüzeyi altında yatan dinamik sitoskeletal ağlara iletilir anlamak için, bir canlı hücre protein dinamiği yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte görüntüleme için uygun bir model sistem gerekiyor. Tipik omurgalı büyüme konileri kantitatif F-aktin ve mikrotübül dinamiklerini analiz etmek için çok küçük. Deniz tavşan Aplysia californica Nöronlar, omurgalı nöronlar 5-10 kat daha büyük oda sıcaklığında kolayca saklanabilir ve mikromanipülasyon ve biyofiziksel ölçümler için çok sağlam hücreler. Onların büyüme konileri çok sitoplazmik bölge ve iyi tanımlanmış bir iskelet sistemi tanımlamıştır. Nöronal hücre gövdeleri büyüme konisinin motilite ve rehberlik eğitimi için probların çeşitli microinjected olabilir. Mevcut protokolde, karın ganglion, çanta hücresi nöronların kültür ve büyüme konileri canlı hücre görüntüleme için bir görüntüleme odası kurma diseksiyonu için bir prosedür ortaya koymaktadır.

Protocol

Çözümler

  • L15-ASW hücre kültür ortamı (1l)
    • 1 torba toz L15
    • 800 ml H 2 O ultra saf eklemek
    • NaCl 400 mm
    • MgSO 4 27 mM
    • MgCl 2 28 mM
    • 4 mM L-Glutamine
    • Gentamisin 50 mg / ml
    • Hepes 5 mm
    • PH 7.9 'a ayarlayın
    • Damla damla CaCl 2 9.3 mM ekle (çökeltileri eğer stop)
    • 1 lt H 2 O ultra saf ekle
    • Ozmometre (buhar basıncı, Wescor # 5520) ozmolarite (950-1000 mg / kg)
    • Filtre 0.22 mikron pozitif basınçlı filtrasyon ünitesi (Millipore SVGV010RS Filtreler) kullanarak
    • 1 ay kadar 4 ° C'de muhafaza
  • Poli-L-lisin (70-150 kD) 200 mg / ml stok solüsyonu steril H 2 O ultra saf -20 ° C'de muhafaza
  • 0.5 M MgCl 2 çözümü

1. Gün: Aplysia karın ganglion diseksiyonu

Enzimatik disosiasyon çözüm hazırlanması

  1. Eppendorf tüp Dispase enzim (LS02111 Worthington, Kedi): 9-10 mg tartılır
  2. Ul 900, L15-ASW kültür ortamı ve steril H 2 O ultrapure 100 ul
  3. Mix ve yerde oda sıcaklığında (RT)

Karın ganglion diseksiyonu

  1. 0.5 M MgCl 2 çözeltisi ile 50 ml şırınga doldurun.
  2. Tanktan bir hayvanın, hayvan mürekkep savunma tepkisini önlemek için nazikçe.
  3. Sol sağ, kaudal tarafında bir diseksiyon tahtada yan Aplysia (strafor kurulu), rostral tarafında yerleştirin.
  4. Sadece başın arkasında hayvan iğne takın ve vücut boşluğuna tüm MgCl 2 çözüm enjekte.
  5. Yavaşça vücut boşluğuna boyunca MgCl 2 çözüm dağıtmak için hayvan ovmak tamamen anestezi hayvan için birkaç dakika bekleyin.
  6. Diseksiyonu kuruluna hayvanın baş ve kuyruk iki iğne ile sabitleyin.
  7. Forseps tarafında büyük bir açılım yapmak için büyük baş ve kuyruk doğru makas ile deri ve kas tabakası ile kesim, cilt kaldırmak için kullanın.
  8. Fırça gibi yumurtalık altında karın ganglion bulun. Karın ganglion önünde yaklaşık 1 cm bağlantı sinirleri tutmak için forseps kullanımı, forseps konumdan önünde ve karın ganglion arkasında diseksiyon makas ile sinirler kesilir.
  9. 22 Dispase çözüm ve 15-16 saat boyunca inkübe içine yerleştirin ganglion ° C sıcaklık kontrollü su banyosu.

2. Gün: Aplysia çanta hücreleri Kaplama

Poli-lizin kaplı lamelleri hazırlanması

  1. Bir akış tezgah, 4 ml L15-ASW orta her doldurma, ganglion diseksiyonu için çalışma yemekleri olarak üç 35mm Petri yemekler hazırlamak. Dispase çözüm karın ganglion sindirim 15.5 saat sonra çalışma yemekler aktarın.
  2. Forseps almak asit temizleme # 1.5 lamelleri (22x22 mm) etanol içinde saklanan, alkol kaldırmak ve Bunsen beki üzerinde kısaca onlara alevli lamelleri sterilize. Lamelleri kültür yemeklerinin içine yerleştirmeden önce onları kısa bir süre soğumasını bekleyin.
  3. Bunsen beki üzerinde sarı bir ucu (alev sadece kısa bir süre plastik erime önlemek için!) Eğilme, kavisli bir kaplama ucu hazırlayın.
  4. 20 mcg / ml poli-lizin çözüm uygun miktarda steril H 2 O ultrapure ile 200 mg / ml stok solüsyonu seyreltilmesi ile hazırlayın.
  5. 20 mg / ml poli-lizin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe 500 ul her lamel örtün.
  6. 500 ul steril H 2 O ultra saf her her lamel 3-5 kez yıkayın.
  7. Lamelleri gelen suyu çıkarın; L15-ASW kültür ortamı 4 ml her çanağı doldurmak.

Çanta hücreleri Fototerapisi

  1. Diseksiyon mikroskobu altında, daha önce% 95 etanol (Şekil 1 satır 1) ile temizlenmelidir yarım kullanarak diseksiyon makas ve forseps karın ganglion kesti.
  2. Çanta hücre küme ve hemiganglion hücreleri (Şekil 1 satır 2) arasındaki kesin ganglion, sinir uzantıları çanta hücrelerinin diğer tarafında kalan (Şekil 1 satır 3) kesip bir yarısında. Bir defada ganglion bir yarım çalışın; tabak içinde, diğer yarısı terk edilirken ilk küme hücre kaplama.
  3. Iki forseps (veya bir forseps ve diseksiyon makas), çanta hücre kümesi etrafındaki bağ dokusu kılıf bir kenara iterek sürüm çanta hücre kümesi. Gerekirse bağ dokusu diseksiyon makas ile kesin. Bu işlem sırasında sıkmak ve çanta hücre kümesi çok fazla dokunmamaya dikkat edin.
  4. En bağ dokusu çıkarılır, b transferbükük sarı ucu ile yeni bir çalışma çanak içine ag hücre kümesi önceden hazırlanmış. Sarı ucu torba hücre kümesi içinde sıkışıp veya hava / orta arayüzü sıkışmış izin vermeyin dikkatli olun.
  5. Bireysel çanta hücreleri çıkarmak için sarı ucu ile küme Karışım. Ucu ve küme pipetleme bunu. Düşük kesme kuvvetleri ile başlayın ve gerektiğinde kuvvetini artırmak. Her zaman çok fazla hücre öldürmeden nöronların kaldırmak için gereken en düşük güç kullanmayın.
  6. 3-5 sağlıklı çanta hücreleri toplamak ve poli-lizin kaplı lamel ile bir çanak aktarabilirsiniz. Ölü hücreleri (onlar merkezinde siyah / şeffaf) ve bağ dokusu enkaz toplayıp kaçının.
  7. 6. adımı tekrarlayın. ve 15-25 canlı nöronlar hakkında her lamel merkezi haline bir yer. Yanı sıra, ölü hücreleri veya enkaz aktarılıyorsa, toplayıp ya da sağlıklı hücreleri uzak üfleme istenmeyen malzeme çıkarmak. Bu süreç, her iki kümeleri için yaklaşık 2-3 saat sürer.
  8. Daha sonra RT en az 2 saat akışını bankta kültür yemekleri tutmak (istenmeyen titreşimi önlemek için akışı tezgah üfleyici tutmak) hücreleri takmak için izin bitirdi.
  9. Yemekler, 14 ° C, gece ya da daha sonra kullanmak kadar bir inkübatör içine yerleştirin. Büyüme konileri, 4-10 saat içinde gelişebilir.

Şekil 1. Aplysia californica karın ganglion şematik. Çanta hücre kümeleri elde etmek için burada kesmek için Renk hatları göstermektedir.
Şekil 1. Aplysia californica karın ganglion şematik. Çanta hücre kümeleri elde etmek için burada kesmek için Renk hatları göstermektedir.

3. Gün: Aplysia çanta hücreleri canlı görüntüleme için oda kurma

Görüntüleme odasının Meclisi

  1. Çanta hücreleri canlı hücre görüntüleme deneyleri için kullanmadan önce, bir düşük güç mikroskobu hücreler inceleyin. Hücrelerin sağlıklı büyüme konileri gelişmiş değil varsa, oda sıcaklığında 1-2 saat için taze orta ve terk kaynağı.
  2. Taze L15-ASW orta plakalar tedarik için eski orta yarısından fazlası (~ 2 ml), bir vakum hattı ile kaldırmak ve 2 ml yeni L15-ASW petri başına orta eklemek. Tamamen bu lamel hücreleri çıkarmak gibi bir defada çanak tüm orta kaldırmak için önemlidir.
  3. Çanta hücre görüntüleme için, biz, bir sandviç gibi görüntüleme odasında iki lamelleri ve iki plastik ayırıcılar monte. Sandviç üst lamel, orta ve reaktiflerin kolay değişimi sağlamak için kısa kesilir. Montaj sırasında yerinden oynatmamaya hücreleri engellemek için her zaman bağlı çanta hücreleri ile lamelleri L15-ASW orta batmış olmalıdır.
  4. Odanın hazırlamak için, kesilmiş ~ 2mm elmas kalem (cam kesici) ve cetvel ile # 1 lamelleri 22x22 mm sağ tarafında.
  5. 1 ml şırınga kullanarak, yüksek vakum gres kısa lamel iki taraf için geçerlidir ve her iki tarafındaki plastik ayırıcılar eklemek. Hem ayırıcılar üst vakum gres yağı uygulayın.
  6. Bir coverglass çanta hücreleri içeren petri lamel ve ara montaj, yer ve tersine çevirin. Aynı hizaya getirin ve yavaşça iki Q-ipuçları ters ucu ile alt üst lamel lamel sopa bastırın.
  7. Forseps kullanarak, yavaşça dışarı sızdıran orta olmadan petri sandviç montaj dışarı çıkarın. Gerekirse, iki lamelleri hizalayın ve bir Kimwipe fazla orta silin. Sandviç, mikroskop lamı sahibinin alt kısmında üzerine yerleştirin ve klipler kullanarak bakım kapağı takın.
  8. Q-ipuçları ile sandviç üst tarafında merkezinde temiz bir cam temizleyicisi (Sparkle cam temizleyici olarak kullanılır) sildi. Ikinci, kuru bir Q-tip ile cam temizleyici çizgileri önlemek için hızlı bir şekilde kurulayın. Alt lamel için de aynı işlemi yapın. Temizlik lamelleri çizgileri ücretsiz yüksek kaliteli görüntüleme için önemlidir.

Çanta hücreleri mikroskop

Aplysia çanta nöronal hücre kültürleri düşük yoğunluklu olduğundan mikroskop hücreleri arasında geçiş kolaylaştırmak için kurulum aşamasında konumlandırma fonksiyonları varsa, bu en iyi olur. Çanta hücreleri kolayca görüntüleme deneyler sırasında sahnede birkaç saat oda sıcaklığında tutulmalıdır. Buharlaşmasını önlemek için düzenli aralıklarla Exchange orta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aplysia çanta hücre nöronlar olmayan çok az sayıda nöron hücreleri ile bir serum serbest nöronal hücre kültürü sistemi sağlar. Bu nöronlar, bir dizi önemli hücre biyolojik soruları çözmek için uygun çok geniş bir büyüme konileri oluşturur. Çanta hücre nöronlar birkaç saat içinde kolayca manipüle ve oda sıcaklığında az görüntülü olabilir. Floresan kullanarak bir F-aktin ve mikrotübül polimerizasyon ve translokasyon dinamiklerinin kantitatif çeşitli parametreler analiz edebilir speckle Mikroskobu (FSM). Geçtiğimiz günlerde serbest bırakılan Aplysia genom bilgilerinin yanı sıra geliştirilmiş ifade teknikleri ile birlikte bu görüntüleme araçları, moleküler ve hücresel mekanizmaları nöronal büyüme konisinin motilite ve rehberlik eğitimi için güçlü bir model sistem bu nöronların olun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Biz Ryan Maneri (Oystercatcher Productions, LLC), diseksiyon video düzenleme ile ilgili yardım için prosedür ve Rodney McPhail (Biyolojik Bilimler Bölümü, Purdue University) çekim için teşekkür etmek istiyorum. Suter laboratuarında Araştırma Purdue Üniversitesi'nde NIH (R01 NS049233) ve Bindley Bioscience Merkezi hibe DMS tarafından desteklenmektedir

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
#1 glass coverslips 22x22 mm Tool VWR international 48366067
#1.5 glass coverslips 22x22 mm Tool Corning 2870-22
35 mm Petri dishes Tool Falcon BD 353001
Filters for medium filtration Tool EMD Millipore SVGV010RS
High vacuum grease Tool Dow Corning 1597418
Osmometer Tool Wescor 5520
Plastic shims Tool Small Parts, Inc. SHSP-200
Calcium chloride Reagent Fisher Scientific C79-500
Gentamicin Reagent Invitrogen 15750-060
HEPES Reagent Sigma-Aldrich H4030
L15 medium Reagent Invitrogen 41300-039
L-glutamine Reagent Sigma-Aldrich G8540
Magnesium chloride Reagent Mallinckrodt Baker Inc. 5958-04
Magnesium sulfate Reagent Mallinckrodt Baker Inc. 6070-12
Poly-L-lysine (70-150 kD) Reagent Sigma-Aldrich P6282
Sodium chloride Reagent Mallinckrodt Baker Inc. 7581
Neutral Protease (Dispase) Reagent Worthington Biochemical LS02111

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
  2. Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
  3. Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
  4. Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).

Comments

4 Comments

  1. to the Suter lab,  Excellent video protocol!Can you provide more detailed information on the signal transduction pathways you looked at in the Aplysia model using the RBI assay? Thank you!Daniel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2008 - 7:58 PM
  2. Dear Daniel, Thank you for your comment. We have studied the role of Src tyrosine kinases in apCAM-mediated growth cone steering using the RBI assay (Suter and Forscher, ²001; Suter et al., ²004). Daniel Suter 

    Reply
    Posted by: Daniel S.
    March 13, 2008 - 9:35 AM
  3. Can you please provide me with a list of neuronal cell lines from Aplysia that can be used for memory related studies

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 21, 2009 - 11:40 PM
  4. Hi Shilpa,

    As far as I know there are no Aplysia neuronal cell lines available. In vitro studies in this system are done with primary neuronal cell cultures.

    Daniel Suter

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 22, 2009 - 3:17 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics