두개골의 창문을 통해 네크로 텍스의 혈류의 2 광자 이미징을위한 방법

Biology

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Summary

대뇌 피질의 혈류 역학은 2 광자 현미경과 설치류 동물의 꼬리 정맥에 주입 이미징 형광 dextran의 염료에 의해 생체내에서 공부하실 수 있습니다. 이 비디오는 어떻게 유리 커버 두개골 윈도우 준비를 통해 마우스의 네크로 텍스의 이미지 혈류 역학을 보여줍니다.

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Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678, doi:10.3791/678 (2008).

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Abstract

생활 설치류의 손상 두뇌에 이미지 대뇌 vasculature (모세 혈관에 대형 선박에서)와 기록 혈류 역학을하는 기능은 강력한 기술입니다. 두개골 창문을 통해 생체내에서 2 광자 현미경을 사용하여 정맥 주사 이미지를 형광 염료 수 있습니다. 이것은 혈액 흐름 측정을 얻기 위해 또한 이미지 외피 vasculature을 한을 허용합니다. 이 기술은 원래 데이비드 Kleinfeld 및 Winfried Denk에 의해 개발되었다. 방법은 neurodegenerative 장애로, 뇌 종양, 또는 정상적인 뇌 생리학에 뇌성 국소 빈혈 동안 또는 후에 혈류 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들면, 그것은 경색과 주변 적혈구 세포 속도 또는 유동적 방법 뇌졸중 원인은 혈액의 흐름 방향으로 교대와 변화 연구에 사용되고 있습니다. 여기서 우리는 꼬리 정맥에 주입 형광 염료를 사용하여 생활 생쥐의 네크로 텍스의 이미지 혈류 역학에 2 광자 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다.

Protocol

형광 dextrans의 염료의 꼬리 정맥 주사

  1. 이미지 대뇌 vasculature하기 위해 동물은 형광 색소를 정맥 주입해야합니다. dextran의 잔기가 뇌 혈액 장벽을 횡단하여 혈관 밖으로 누출에서 염료를 방지하기 때문에 우리는 dextran - 복합 염료를 사용합니다.
  2. 마우스 (유도 4 %, 사출 중 1.5-2 %) isoflurane과 anesthetized 있습니다.
  3. 꼬리는 70 % 알코올로 소독합니다.
  4. 26 게이지 바늘로, 호수에 녹아있는 rhodamine dextran의 5 % V / V 솔루션의 75-100 μl는 꼬리의 축을 따라 꼬리 정맥을 통해 주입 도중입니다.
  5. 염료는 약 2 시간 rhodamine의 염료를 사용하는 경우 분홍색으로 바뀔 것이다 소변에 배설 때까지 동물은 즉시 꼬리 정맥 주사 후 몇 군데있을 수 있습니다.

두 광자 현미경을 사용하여 혈액 흐름의 이미징 (몇 군데 선박의 수에 따라 총 소요 시간 30-60 분 세션 당)

  1. 형광 염료 dextran 사출 다음, 마우스 (유도 4 %, 영상에 대한 1-1.5 %) isoflurane과 anesthetized 있습니다.
  2. 마우스는 단단히 동물 보온 온도 조절 난방 패드가 들어있는 현미경 단계에 티타늄 막대를 사용하여 첨부되어 있습니다. 일부 눈 연고는 눈을 촉촉한 유지에 적용됩니다.
  3. 두개골 창의 커버 유리는 70 % 알코올로 세척합니다.
  4. 창이 초점 평면에 평행하게 위치하고 4X 목표 아래보기의 분야에서 중심이다.
  5. 디지털 카메라와 함께 뇌 표면 선박의 사진을하는 것이 좋습니다. 이 사진은 하루 하루에서 반복적으로 몇 군데 지역을 찾을 수 이미징 세션을 아래에있는 참조 이미지로 사용됩니다.
  6. 4X 목적은 무대를 이동하지 않고 물이 침수 40X 목적으로 바뀝니다. 보기의 분야의 디지털 사진을 다시 촬영합니다. 무대 조작하는 사람의 좌표는 제로에 설정됩니다.
  7. 우리는 이미지 수집 소프트웨어로 ScanImage를 사용합니다. 이것은 카렐 스보보다 (Pologruto 외., 2003)의 실험실에서 톰 Pologruto와 베르나르도 사바 티니에 의해 MatLab로 작성되었습니다. 레이저, 전원 측정기, 사진 배율 튜브, 증폭기 등 : 우리는 다음 다른 모든 장비 설정
  8. 몇 군데로 적합한 창의 면적은 간단히 최상의 영역을 찾기 위해 낮은 배율에서 스캔합니다. 일단 이들은 이미지가 촬영입니다 선택한 지역의 낮은 배율 스택을 확인하며, XY 좌표는 주석입니다.
  9. 작은 혈관이나 모세 혈관의 혈액 흐름 역학을 기록하기 위해 우리의 관심 선박의 최소한 40 μm의 라인을 따라 스캔을 사용합니다. 이 싱글 "소탕"지속적인 일초가 작은 레이저 가능한 능력과 스캔의 좌표와 각도를 아래로 쓰기로 사용하시면됩니다.
  10. 이미지 세션이 끝난 후, 동물의 그것은 마취에서 복구할 수 있습니다 따뜻한 실내로 이동합니다.

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Discussion

대뇌 피질의 혈류 역학은 두 광자 현미경과 설치류 동물의 꼬리 정맥에 주입 이미징 형광 dextran의 염료에 의해 생체내에서 공부하실 수 있습니다. 이 비디오는 어떻게 유리 커버 두개골 윈도우 준비를 통해 마우스의 네크로 텍스의 이미지 혈류 역학에 대한 방법을 보여주었다.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fluorescein isothio-cyanate-dextran Reagent Sigma-Aldrich FD500S mol wt 500,000
Rhodamine B isothio-cyanate-dextran Reagent Sigma-Aldrich R9379 mol wt ~70,000

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References

  1. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).
  2. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).
  3. Zhang, S., Murphy, T. H. Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo. 5, (2007).
  4. Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).

Comments

1 Comment

  1. Hi Carlos

    What is the thickness of the coverslip?thanks!

    Reply
    Posted by: Niloufar K.
    January 18, 2016 - 12:04 PM

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