Um método para 2-Photon Imagens de Fluxo de Sangue no neocórtex através de uma janela Cranial

Biology

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Summary

Dinâmica do fluxo sanguíneo cortical pode ser estudada in vivo por corantes fluorescentes imagem dextran injetado na veia da cauda dos roedores com 2-fótons microscopia. Este vídeo mostra como a dinâmica do fluxo sanguíneo na imagem neocórtex de ratos através de um vidro coberto de preparação janela craniana.

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Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678, doi:10.3791/678 (2008).

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Abstract

A capacidade de imagem da vasculatura cerebral (a partir de navios de grande porte para capilares) e dinâmica registro de fluxo sanguíneo no cérebro dos roedores que vivem intacta é uma técnica poderosa. In vivo utilizando dois fótons de microscopia através de uma janela cranial é possível corantes fluorescentes imagem injetada por via intravenosa. Isto permite uma imagem para a vascularização cortical e também para obter medidas de fluxo sanguíneo. Esta técnica foi desenvolvida originalmente por David Kleinfeld e Winfried Denk. O método pode ser usado para estudar a dinâmica do fluxo sanguíneo durante ou após a isquemia cerebral, em doenças neurodegenerativas, em tumores cerebrais, ou na fisiologia normal do cérebro. Por exemplo, ela tem sido usada para estudar como acidente vascular cerebral provoca mudanças na direção do fluxo do sangue e alterações na velocidade de glóbulos vermelhos ou fluxo em e ao redor do infarto. Aqui demonstramos como usar dois fótons de microscopia para a dinâmica do fluxo sanguíneo imagem no neocórtex de ratos vivos usando corantes fluorescentes injetadas na veia da cauda.

Protocol

Cauda veia injeções de corantes fluorescentes dextranos

  1. De modo a vasculatura cerebral imagem, os animais devem ser injetados por via intravenosa com um corante fluorescente. Usamos dextran-conjugados corantes porque a molécula de dextran impede a tintura de atravessar a barreira hematoencefálica e vazando dos vasos sanguíneos.
  2. Os ratos são anestesiados com isoflurano (4% para a indução, 1,5-2% durante a injeção).
  3. Cauda é desinfetada com álcool 70%.
  4. Com uma agulha de calibre 26, 75-100 mL de uma solução 5% v / v de rodamina dextran dissolvido em solução salina é injetada através da veia da cauda, ​​a meio caminho ao longo do eixo da cauda.
  5. Os animais podem ser visualizados imediatamente após a injeção veia da cauda até a tintura é excretada na urina, que irá transformar-de-rosa, se utilizando um corante rodamina em cerca de 2 horas.

Imagem do fluxo sanguíneo através de dois fótons de microscopia (duração total 30-60 min por sessão, dependendo do número de navios com imagens)

  1. Após a injeção de corante fluorescente dextran, o mouse é anestesiado com isoflurano (4% para a indução, 1-1,5% para geração de imagens).
  2. Mouse está firmemente ligado usando a barra de titânio para o estágio do microscópio, que contém uma almofada de aquecimento termo-regulada para manter o animal aquecido. Alguns pomada é aplicada para manter os olhos úmidos.
  3. A tampa de vidro da janela cranial é limpa com álcool 70%.
  4. A janela é posicionada paralelamente ao plano focal e centrado no campo de visão no âmbito do objectivo 4X.
  5. É melhor para tirar uma fotografia dos vasos superfície do cérebro com uma câmera digital. Esta imagem será usada como imagem de referência em seguir as sessões de imagem para encontrar a região fotografada várias vezes no dia a dia.
  6. O objetivo 4X é substituído com o objetivo de imersão em água 40X sem se mover no palco. Uma imagem digital do campo de visão é tomada novamente. As coordenadas no manipulador estágio são fixados em zero.
  7. Usamos scanimage como o software de aquisição de imagem. Isto foi escrito em MatLab por Tom Pologruto e Sabatini Bernardo no laboratório de Karel Svoboda (Pologruto et al., 2003). A seguir, ligue todos os outros equipamentos: o laser, o medidor de energia, os tubos foto multiplicadores, os amplificadores, etc
  8. A área da janela adequada a ser trabalhada é brevemente digitalizadas em baixa ampliação para encontrar as melhores regiões. Uma vez que estes são identificados, uma pilha de baixa ampliação da região escolhida para a imagem é tirada, e coordena a sua XY são anotadas.
  9. Para gravar dinâmica do fluxo de sangue nos pequenos vasos capilares ou usamos scans linha ao longo de pelo menos 40 mM do navio de interesse. Estes single "varre" um segundo duradoura são feitas utilizando-se como potência do laser mínimo possível e as coordenadas e ângulo de varredura são escritos para baixo.
  10. Assim que a sessão de imagem é longo, o animal é movido a uma câmara quente, onde ele pode se recuperar da anestesia.

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Discussion

Dinâmica do fluxo sanguíneo cortical pode ser estudada in vivo por corantes fluorescentes imagem dextran injetado na veia da cauda dos roedores com dois fótons de microscopia. Este vídeo mostra um método de imagem como a dinâmica do fluxo sanguíneo no neocórtex de camundongos através de um vidro coberto de preparação janela craniana.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fluorescein isothio-cyanate-dextran Reagent Sigma-Aldrich FD500S mol wt 500,000
Rhodamine B isothio-cyanate-dextran Reagent Sigma-Aldrich R9379 mol wt ~70,000

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References

  1. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).
  2. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).
  3. Zhang, S., Murphy, T. H. Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo. 5, (2007).
  4. Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).

Comments

1 Comment

  1. Hi Carlos

    What is the thickness of the coverslip?thanks!

    Reply
    Posted by: Niloufar K.
    January 18, 2016 - 12:04 PM

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