في فيفو 2 فوتون التصوير الكالسيوم في طبقة 2 / 3 من الفئران

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

لفهم ديناميات شبكة من رقائق في القشرة المخية الحديثة ، فإنه من الضروري في نفس الوقت لتسجيل نشاط عدد كبير من الخلايا العصبية. داخل الجسم الحي اثنين الفوتون التصوير الكالسيوم هو الأسلوب الوحيد الذي يسمح احد لتسجيل نشاط الخلايا العصبية من سكان كثيفة مع وحيدة الخلية القرار.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Golshani, P., Portera-Cailliau, C. In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice. J. Vis. Exp. (13), e681, doi:10.3791/681 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

لفهم ديناميات شبكة من رقائق في القشرة المخية الحديثة ، فإنه من الضروري في نفس الوقت لتسجيل نشاط عدد كبير من الخلايا العصبية. داخل الجسم الحي اثنين الفوتون التصوير الكالسيوم هو الأسلوب الوحيد الذي يسمح احد لتسجيل نشاط الخلايا العصبية من سكان كثيفة مع وحيدة الخلية القرار. طريقة تتمثل في زرع نافذة التصوير الجمجمة ، حقن صبغة الفلورسنت مؤشر الكالسيوم التي يمكن اتخاذها من قبل أعداد كبيرة من الخلايا العصبية وأخيرا تسجيل نشاط الخلايا العصبية مع مرور الوقت باستخدام التصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، two المجهر الفوتون. شارك في حقن الأصباغ نجمية محددة يسمح احد لتمييز الخلايا العصبية من الخلايا النجمية. يمكن تنفيذ هذا الاسلوب في التعبير عن جزيئات الفلورسنت الفئران في مجموعات سكانية فرعية معينة من الخلايا العصبية لفهم أفضل للتفاعلات شبكة من مجموعات مختلفة من الخلايا.

Protocol

  1. إعداد مؤشر الكالسيوم الفلورسنت الحل. نستخدم الأصباغ استر acetoxymethyl ، أو الأصباغ AM قصيرة. هذه الأصباغ التي يمكن اتخاذها من قبل الخلايا عند حقنها خارج الخلية. نستخدم عادة ولاية أوريغون والخضر BAPTA - 1 - Fluo صباحا أو 04:00 في تركيز 1 ملم. ويمكن الحصول على الأصباغ صباحا من Invitrogen 50 ميكروغرام في قارورة. نحن نستعد لأول مرة حل 20 ٪ من Pluronic F - 127 في DMSO. نحن الحار الحل قبل استخدامها كل يوم حتى واضحة لها. نحن بحل مؤشر الكالسيوم F-127/DMSO Pluronic 20 ٪ لمدة 15-20 دقيقة إلى تركيز من 10 ملم. ثم أننا تمييع الحل ل1MM في محلول يحتوي ، في ملي : 150 كلوريد الصوديوم ، 2.5 بوكل ، 10 Hepes ، ودرجة الحموضة 7.4. بالإضافة إلى ذلك ، وعادة ما يتم Sulforhodamine 100 ميكرومتر من 101 إلى النجمية التسمية وتصور ماصة خلال الحقن. نحن تصفية حل قبل الحقن مع فلتر ميكرون 0.49 الطرد المركزي (Stosiek وآخرون ، 2003 ؛. Garaschuk وآخرون ، 2006).

  2. زرع نافذة الجمجمة على المنطقة المراد تصويره. لقد كنا وصفت في النهج العام إن الرب ، ولكن التعديلات التالية مهمة لحقن الصبغة الكالسيوم :

    جعل أصغر حج القحف من 2 ملم وقطرها على المنطقة القشرية ذات الاهتمام ، مع الحرص الشديد على عدم الإضرار الجافية الكامنة. تأمين ساترة في المكان خلال حج القحف ، ولكن جزئيا فقط تغطية حج القحف ، مما يترك فجوة صغيرة بين حافة حج القحف وساترة الزجاج للسماح للغرفة ماصة للدخول في القشرة بشكل غير مباشر. قبل الحقن ، وجعل بئر ضحل مع الاسمنت الأسنان حول حج القحف. ينبغي أن تمتد بشكل جيد كما هو الحال في اتجاه منقاري وتكون ضحلة بما يكفي للسماح للmicropipette الإدراج للحقن.

  3. نقل الماوس نقله إلى مرحلة المجهر ويستوقف في الرأس ، كما هو مبين من خلال موقعنا على تصوير الفيديو تدفق الدم .

  4. سحب ماصات microelectrode الزجاج ليبلغ قطرها غيض الغلة 2-4 ميغا أوم في المقاومة ، وذلك باستخدام ماصة مجتذب. تحميل الصبغة مؤشر على مزيج من الكالسيوم والزجاج باستخدام ماصة microsyringe. باستخدام micromanipulator ، وانخفاض micropipette برفق على سطح الدماغ باستخدام 4X الهدف الذي وضعه ناعما ثم تحت الهدف 40X. اختيار موقع مناسب للحقن ، مثل أن هناك عدد قليل أو لا الأوعية الدموية المغطي لحجب التصوير. باستخدام اثنين من الفوتون المجهري ، وغيض من ماصة هو تصور والمتقدمة ببطء داخل القشرة ، إلى عمق 200 ميكرومتر تحت الجافية. ثم ، وضغط حقن صبغة الخليط في 10 PSI لمدة 1 دقيقة باستخدام Picospritzer. نقدم عادة 2-4 حقن الصبغة AM مزيج من الكالسيوم ، وفصلها في الفضاء بنحو 200-300 ميكرون. هذا النهج تحميل الجزء الأكبر من الحقن تداخل قليلا يضمن بشكل كاف الملون مساحة كبيرة مثل 600 × 600 ميكرون للتصوير الكالسيوم. يبدأ التصوير 1 بعد ساعة من الحقن من هذا الخليط صباحا صباغة ، للسماح لصبغ لنشر وسيتم تناولها من خلال الخلايا العصبية.

  5. أداء داخل الجسم الحي اثنين الفوتون التصوير مع العرف مجهر ثنائي الفوتون باستخدام TI - الياقوت الحرباء ليزر (ضبطها ل800-880 نانومتر) والمرايا كامبريدج الجلفانومتر التكنولوجيا. علينا الحصول على الصور باستخدام برامج ScanImage ضعت في مختبر للكاريل سفوبودا (Pologruto وآخرون ، 2003). الليزر السلطة هي عادة أقل بكثير من 70 ميغاواط في العينة. يتم الحصول على الصور الحقل بأكمله باستخدام إما 20X (0.95 NA) أو 40X (0.8 NA) أهداف أوليمبوس ، 1،95-15،63 في لقطة في الثانية (512 × 256 بكسل إلى 256 × 64 بكسل). يتم الحصول على خط بفحص 500 هرتز. خلال التصوير ، ويتم الاحتفاظ الحيوانات تحت التخدير isoflurane الخفيفة (0،6-0،9 ٪) ، ويتم الاحتفاظ أيضا عند 37 درجة مئوية درجة الحرارة باستخدام جهاز هارفارد جهاز التحكم. هو الحرص على الحفاظ على معدل التنفس الحيوانات أقرب إلى 100 الأنفاس / دقيقة قدر الإمكان. هذا المستوى من استخدام التخدير هو أدنى مستوى الذي يشل هذا الحيوان ، ولكن لا يزال يسمح النشاط العفوي ليتم تسجيلها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ميزة هذا الأسلوب أكثر من التسجيلات الكهربية هو أنه أقل الغازية ويسمح للتسجيلات نشاط الخلايا العصبية في شبكات كثيفة العصبية. عندما تفعل هذا الإجراء فإنه من المهم أن نتذكر أن تأخذ الحذر الشديد عند أداء حج القحف لا يلحق الضرر الجافية. حتى كمية صغيرة من نزيف تحت الجافية مع غامضة إلى حد كبير من التصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نود أن نعترف أولغا Garaschuk لإجراء مناقشات مفيدة حول الاستفادة المثلى من تحميل الجزء الأكبر من مؤشرات الكالسيوم.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Oregon Green BAPTA1-AM Reagent Invitrogen O-6807
Fluo 4- AM Reagent Invitrogen F-14201
Sulforhodamine 101 Reagent Invitrogen S-359
Pluronic F-127 in DMSO Reagent Invitrogen P-3000MP
Centrifugal Filter (0.45 micron) Reagent EMD Millipore UFC3 0HV 0S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
  2. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).
  3. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.   Biomed Eng Online 2:13. Biomed Eng Online. 2, (2003).

Comments

13 Comments

  1. Dear Dr. Golshani,     Do you close the craniotomy site completely with the coverslip and secure it after the injection fo the indicator?  Or do you image with the half open craniotomy hole?  Also during craniotomy, do you keep the animal under deeper anesthesia unlike during imaging? Thanks James T. Russell

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 15, 2008 - 11:27 AM
  2. Hi James,   I image with a ²/3 closed craniotomy.  The craniotomy is performed under isoflurane anesthesia (breath-rate around 60-80) with all withdrawl reflexes completely suppressed.  We image animals under light isoflurane anesthesia (with the breath-rate close to 100 bpm).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2008 - 8:30 PM
  3. Any trick to go trough the dura with the pipette ? (as opposed to just push the dura with the pipette) Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 17, 2008 - 11:56 AM
  4. We position the pipette at 30 degrees to the dura, and then slowly advance it into the brain.  We have had no problems with the pipette breaking or with penetration of the dura.  We are imaging mice.  The situation may be different with rats or other animals.   Peyman

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2008 - 8:32 PM
  5. Dear Dr. Golshani,
    Thanks for your share.In my lab,we use P-97 Micropipette Puller.Could you tell me the Parameters for pulling the Micropipette in your experiment?
    Thanks.
    feili

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 4, 2009 - 7:44 AM
  6. Dear Dr. Golshani,
    I am wondering if you used the recording chamber, just as in Garaschuk's paper.

    Thanks,
    Melissa

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 12, 2010 - 3:19 AM
  7. No, the cortex buffer solution is stationary above the brain. Garaschuk uses a perfusion method, much like slice recordings.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 13, 2010 - 12:22 PM
  8. Hi Dr. Golshani,
    thanks for the great video. I have a question about using fluo-4--I find it much trickier than using OGB-1. It seems not to dissolve as well--when I filter it, there seems to be a large amount of the dye filtered out, even if I've vortexed and sonicated for half an hour, leaving the resulting solution very pale. Is this normal, or there any trick to using fluo-4 (warming the solution? sonicating for longer?) as opposed to OGB-1?
    thanks very kindly,
    Kelly

    Reply
    Posted by: Kelly C.
    November 10, 2010 - 6:47 PM
  9. I treated Fluo-4 just like OGB and was able to stain a smaller proportion of cells. Cells appear dimmer but flash brighter with each spike.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2010 - 8:08 PM
  10. Thanks--maybe I am just using the wrong filter material. Can you recommend the model of filter you use for your solution? Thanks!

    Reply
    Posted by: Kelly C.
    November 12, 2010 - 2:28 PM
  11. The filter is mentioned above: 0.45 micron centrifugal filter.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 17, 2010 - 10:42 AM
  12. Right sorry, I meant, what manufacturer/model number? The filter material itself might play a role in affecting the final dye concentration--for example if the material has an affinity for esters or something of that nature.
    Thanks!

    Reply
    Posted by: Kelly C.
    November 18, 2010 - 4:42 PM
  13. Hi Dr. Golshani and Portera-Cailliau,

    Thanks for the excellent video! We mean to begin performing experiments with a similar method and I have a quick question. Are you able to perform the experiments chronically, or must it be acute because the entire cortex is not covered and presumably the imaging window becomes occluded?

    Thanks!

    Reply
    Posted by: William F.
    December 10, 2012 - 4:17 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics