رني المترجمة خارج الرحم والتعبير الجيني في المستنزف الطبية

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

في هذا الفيديو ، وتبين لنا لإجراء التسليم an biolistic دقيقة من الكواشف في الأنسجة الحية بمسدس الجينات مصغرة الرواية. نحن هدمت التعبير عن جزيء محوار Netrin التوجيه في الأجنة علقة من خلال تقديم جزيئات الرنا المزدوج الجديلة في الجدار البطني الجسم والعقد من شرائح واحد.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech. J. Vis. Exp. (14), e697, doi:10.3791/697 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

في هذا الفيديو ، وتبين لنا من استخدام بندقية تعمل بالهواء المضغوط الشعرية لتسليم biolistic دقيقة من الكواشف في الأنسجة الحية. نستخدم الإجراء لأنماط التشويش على التعبير الجيني في قطاعات مختارة من أجنة علقة ، وترك دون علاج وشرائح الضوابط الداخلية.

ويمكن استخدام البندقية الهوائية للوصول إلى طبقات الشعرية الداخلية من الخلايا في مراحل مبكرة من التنمية دون فتح العينة. كوسيلة لإدخال المواد المترجمة في الأنسجة الحية ، وتسليم biolistic بالبندقية ديها العديد من المزايا : فهي سريعة ، اتصل خالية وغير مدمرة. بالإضافة ، يمكن استخدام بندقية واحدة للتسليم الشعرية المستقلة من المواد المختلفة. يمكن تسليم المنطقة أبعادا الوحشي 50-150 ميكرومتر ~ ويمتد على مدى 15 ميكرومتر ~ حول عمق الاختراق يعني ، وهو قابل للتعديل بين 0 و 50 ميكرومتر. هذا التسليم لديها ميزة كونها قادرة على استهداف عدد محدود من الخلايا في الموقع المحدد وسيطة بين خلية واحدة هدم من قبل microinjection ضربة قاضية والنظامية من خلال الحقن خارج الخلية أو عن طريق الأساليب الوراثية.

لهدمت أو طرق في التعبير عن جزيء محوار Netrin التوجيه ، وهو ما يعبر عنه بشكل طبيعي من جانب بعض الخلايا العصبية المركزية ، وجدار الجسم في بطني ، ولكن ليس في المجال الظهرية ، التي نقدمها من جزيئات الرنا المزدوج الجديلة أو البلازميد الحمض النووي في الجسم والجدار وسط العقد. هذا الإجراء يشمل الخطوات التالية : (ط) إعداد برنامج الإعداد التجريبية لفحص محددة (ضبط ضغط متسارعة) ، (ب) طلاء الجزيئات مع جزيئات الحمض النووي أو الرنا المزدوج الجديلة ، (الثالث) تحميل الجزيئات المغلفة في البندقية ، ما يصل الى اثنين في واحد الكواشف مقايسة ، (د) اعداد الحيوانات لإيصال الجسيمات ، (V) تسليم الجزيئات المغلفة في الأنسجة المستهدفة (جدار الجسم أو العقد) ، و (السادس) معالجة الأجنة (immunostaining ، المناعية والعصبية التوسيم) لتصور النتائج ، عادة من 2 إلى 3 أيام بعد الولادة.

تسبب عندما كانت مغلفة الجسيمات مع الرنا المزدوج الجديلة netrin ، مرئية بوضوح تدق إلى أسفل التعبير netrin التي وقعت فقط في الخلايا التي تحتوي على جزيئات (عادة ، 1-2 الجسيمات في الخلية). جسيمات المغلفة مع مضان ترميز البلازميد يسببها EGFP في الخلايا العصبية عندما توقفت في النواة.

Protocol

يمكن أن تكون مغلفة مع الكواشف الجسيمات مختلفة ، مثل جزيئات الرنا المزدوج الجديلة ، البلازميدات الحمض النووي أو الأصباغ. ويتم اختيار نوع وقطر من الجسيمات وفقا للكاشف وعمق الخلايا المستهدفة في النسيج : أكبر اختراق جسيمات أخرى ، ولكن قد يسبب بعض الأضرار التي لحقت الأنسجة.

1. إعداد جزيئات الرنا المزدوج الجديلة المغلفة

  1. مكان 100 ٪ الأيزوبروبانول على الجليد.
  2. Resuspend الذهب 5 ملغ الجسيمات (S1600ri ، الصدف التكنولوجيا ، ذ ؛ قطرها 1.6 ميكرومتر في المتوسط) في المخزن 100 مل ملزمة. عندما حل جاهز ، انتقل إلى الخطوة التالية.
  3. تمييع الحل الجسيمات بإضافة 100 ميكرولتر من العازلة ملزمة ، لفترة وجيزة الدوامة ويصوتن لمدة 1-2 دقيقة لتجنب تراكمها.
  4. إضافة 5 - 10μg من الرنا المزدوج الجديلة / سيرنا (ينبغي حله dsRNAs / سيرنا في الماء لتركيز ~ 1μg/μl).
  5. دوامة وترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. المشبعة هذه النتيجة والوقت الفاصل تركيز جزيئات الذهب في سيرنا.
  6. بيليه المجمعات الجسيمات سيرنا / الذهب بواسطة الطرد المركزي في 2500 دورة في الدقيقة ~ في جهاز للطرد المركزي لمقاعد البدلاء أعلى ~ 15 ثانية.
  7. إزالة طاف وإضافة 750 مل بلطف الباردة الأيزوبروبانول مع انقطاع الحد الأدنى من بيليه. تدور لفترة وجيزة وإزالة طاف.
  8. Resuspend جزيئات الذهب في 100 الأيزوبروبانول الباردة ميكرولتر 100 ٪ ، ثم يصوتن لفترة وجيزة في sonicator حمام (2-3 البقول) لتفتيت الكتل الجسيمات. الماضي ، صب الجسيمات العالقة على شريحة زجاجية والسماح ليجف في درجة حرارة الغرفة.

2. إعداد الإعداد التجريبية لفحص محددة

  1. كل بندقية له فتحة فوهة قطرها مختلفة ، تتراوح بين حد أدنى من ~ ~ 50μm تصل إلى 3mm. يتم اختيار بالتالي محددة لاستخدامها في البندقية وفقا لمساحة من الأنسجة لتكون مستهدفة.
  2. يتم ضبط الضغط ولعمق في أنسجة الخلايا المستهدفة ، وتصل عموما إلى ~ 100μm (أعلى الضغوط يمكن تقديم جزيئات أعمق). المسافة بين الجنين وغيض من فوهة يؤثر أيضا على عمق الاختراق ، والزخم جزيئات الذهب فضفاضة في الهواء.

3. تحميل بندقية مع جزيئات قبل المغلفة

يجب أن يتم تحميل الجسيمات على شكل مسحوق جاف في خطوط أنابيب حقن tygon الجسيمات متصلة متعددة. هذا الأنبوب ، الذي ينبغي أن تبقى في الجو الجاف في 4 درجات مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال ، ويمكن إعادة استخدامها في تجارب إضافية مع الكواشف نفسه. ويمكن الإعداد لدينا التجريبية تقديم ما يصل الى اثنين من الكواشف المختلفة في الفحص عن طريق الموانئ منفصلة في مشعب.

  1. كشط الجزيئات المجففة من الزجاج المطلي الشرائح باستخدام حافة الانزلاق زجاج غطاء أو شفرة حلاقة قبل تحميلها في خط أنابيب tygon. هذا وسوف تكون محددة أنابيب tygon الوحيد لهذا كاشف لتجنب التلوث المتبادل.
  2. كما يمكنك تحميل الجزيئات ، ثني الأنابيب في شكل U على مقربة من الموصل ، للحفاظ على جزيئات من الانتشار على طول الأنبوب وكلها تتركز على مقربة من الموصل. التقاط الجزيئات مع ملعقة صغيرة أو قطعة من الورق تزن مطوية ، وتحميل نصفهم تقريبا من داخل أنابيب لكل مجموعة من الأجنة. الاستفادة من الأنابيب خلال الخطوة التحميل لانتشار الجزيئات بشكل متساو.

4. تحضير الحيوانات

قبل وبعد الولادة جسيمات الذهب ، ويتم الاحتفاظ الأجنة في المياه المعقمة بركة اصطناعية في درجة حرارة الغرفة.

  1. وضع الأجنة ، حتى الجانب البطني ، في أخدود محفورة على قطعة مسطحة 5mm سميكة ، من مطاط السيليكون (Sylgard 184 ، داو كورننغ ، ميدلاند ، MI) وتخدير لهم في حل من الإيثانول بنسبة 8 ٪ في مياه البرك الاصطناعية المعقمة ( يمكن الأصغر الأجنة في المراحل E6 - E8 البقاء في مياه البرك الاصطناعية مع أي الايثانول في كافة مراحل التجربة).
  2. مباشرة قبل اطلاق النار على الجسيمات ، وانخفاض مستوى الحمام للكشف عن السطح البطني للأجنة عن طريق إزالة جزء من الحل. ضع قطعة من المناديل الورقية مع وجود ثقب صغير في منتصف قطع على أعلى من ذلك لتحقيق الاستقرار فيه والى الحفاظ على سطحه من التجفيف.

5. تسليم الجزيئات المغلفة في النسيج المستهدف

ويمكن عادة واحدة من الجزيئات تحميل استخدامها لمدة تصل إلى عشر طلقات ، مع تسليم رصاصة واحدة عادة على أمر صادر عن بضع مئات من الجزيئات.

  1. تولد النار عن طريق فتح واحد من صمامات لل0.3 ثانية ، مما تسبب في حقن البلعة من جسيمات من خط أنابيب في المقابلة البندقية.
  2. اضغط على أنابيب برفق بين لقطات لطرد الجسيمات من جدار الأنابيب ، وبالتالي تسهيل الحقن الخاصة في مجرى والبندقية.
  3. لتغطية المنطقة من الأنسجة من الفائدة ، قد يكون مطلوبا لقطات متعددة.
  4. بعد تسليم الجسيمات ، ووضع الأجنة العودة الى مياه البركة الاصطناعية ، ويفضل أن يكون جيدا في جنين واحد في لوحة متعددة أيضا.

6. المناعيةتلوين ووضع العلامات العصبية

الحفاظ على الأجنة في درجة حرارة الغرفة وفي ظلام دامس لمدة 1-3 أيام بعد تسليم الجسيمات ، حتى يتحقق رني (أو التعبير خارج الرحم). نحن ثم تنفيذ أحد الإجراءات التالية على العينات التجريبية والضوابط :

  1. التهجين في الموقع لفحص عن وجود أو عدم وجود Netrin مرنا. والمهجنة Digoxigenin المسمى علقة riboprobes netrin إلى الأجنة علقة كلها.
  2. كيمياء سيتولوجية مناعية لفحص لبروتين Netrin والبروتينات الأخرى التي هي فريدة من نوعها في الأنسجة العصبية (مثل مكافحة تويولين الأسيتيل). يتم تنفيذ هذا الإجراء أيضا على كامل جبل الأجنة.
  3. Microinjections من الأصباغ محبة للدهون (الجاذبة وديو) في الخلايا العصبية واحد ، لصبغ يملأ لتسمية العرش كاملة من الخلايا العصبية من الفائدة (العصبونات الضغط mechanosensory في حالتنا) في قطاعات المعالجة والسيطرة. يتم إجراء هذا الاختبار على الأجنة الحية (سليمة أو تشريح).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المظاهرة ، كنا البندقية الهوائية الشعرية لتقديم جزيئات الذهب في الخلايا المترجمة في حجم صغير من الجنين علقة لضرب العيش في وتدق إلى أسفل الجينات. المنطقة المستهدفة كانت عموما يبلغ قطرها 150 ~ تم العثور على جزيئات ميكرومتر و~ 15 ميكرون حول عمق الاختراق يعني ، الذي قابل للتعديل بين 0 و 50 ميكرومتر. تسبب عندما كانت مغلفة الجزيئات مع جزيئات الرنا المزدوج الجديلة عامل محوار netrin التوجيه ومرئية بوضوح تدق إلى أسفل التعبير netrin التي وقعت فقط في الخلايا التي تحتوي على جسيمات. جسيمات المغلفة مع مضان ترميز البلازميد يسببها GFP في الخلايا العصبية عندما توقفت في النواة.

لقد أظهرنا كيف البندقية الهوائية الشعرية يعطي أسلوب التسليم biolistic قدرة جديدة لاستهداف مناطق المجهري لأنسجة تنحصر في ثلاثة أبعاد وهادفة مع دقة عالية ، من دون كشف الضرر على الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

نود أن نشكر الدكتور مايكل بيكر لمساعدته في توليد بنيات لتدق في الجينات وتقديم الأفلام مرور الزمن من التوقعات المتزايدة الحسية. نود أيضا أن نشكر Vandelinder فرجينيا لتقديم المساعدة التقنية مع التجارب بندقية تعمل بالهواء المضغوط.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
gold particles Other Seashell Technology, LLC S1600ri
binding buffer Reagent Seashell Technology, LLC
silicone rubber Reagent Dow Corning Sylgard 184

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
  2. Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
  3. Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
  4. Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
  5. Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Applied Physics Letters. 87, 014103- (2005).
  6. Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics