Localizada RNAi y la expresión génica ectópico en la sanguijuela medicinal

Biology

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Summary

En este vídeo, se muestra un procedimiento para realizar una entrega precisa biolística de reactivos en el tejido vivo con una pistola de genes en miniatura novela. Estamos derribando la expresión de la molécula de Netrin axón orientación en los embriones de sanguijuela mediante la entrega de las moléculas de dsRNA en la pared ventral del cuerpo y los ganglios de los segmentos individuales.

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Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech. J. Vis. Exp. (14), e697, doi:10.3791/697 (2008).

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Abstract

En este video, se muestra el uso de una pistola neumática capilar para la entrega precisa biolística de reactivos en el tejido vivo. Utilizamos el procedimiento para perturbar los patrones de expresión génica en los segmentos seleccionados de embriones de sanguijuelas, dejando a los segmentos no tratados como los controles internos.

La pistola neumática capilar se puede utilizar para llegar a las capas internas de las células en las primeras etapas de desarrollo sin necesidad de abrir la muestra. Como un método para la introducción de las sustancias localizadas en los tejidos vivos, la entrega biolística con la pistola tiene varias ventajas: es rápido, sin contacto y no destructiva. Además, una pistola capilar solo puede ser utilizado para la entrega independiente de las diferentes sustancias. La región de la entrega puede tener dimensiones laterales de ~ 50-150 micras y se extiende sobre unos 15 m alrededor de la profundidad de la penetración media, que es ajustable entre 0 y 50 micras. Esta entrega cuenta con la ventaja de ser capaz de dirigirse a un número limitado de células en un lugar intermedio seleccionado entre célula derribar por microinyección y caída sistémica a través de inyecciones extracelular o por medio de métodos genéticos.

Para derribar o golpear en la expresión de la molécula de Netrin orientación axón, que es, naturalmente, expresadas por algunas neuronas centrales y en la pared ventral del cuerpo, pero no el dominio dorsal, nosotros entregamos las moléculas de dsRNA o un plásmido de ADN en la pared del cuerpo y ganglios centrales. Este procedimiento incluye los siguientes pasos: (i) la preparación de la instalación experimental de un ensayo específico (ajuste de la presión de aceleración), (ii) recubrimiento de las partículas con las moléculas de dsRNA o el ADN, (iii) la carga de las partículas recubiertas en la pistola, hasta dos reactivos en un ensayo, (iv) la preparación de los animales para la entrega de las partículas, (v) la entrega de las partículas recubiertas en el tejido objetivo (pared del cuerpo o de los ganglios), y (vi) el tratamiento de los embriones (tinción de inmunohistoquímica y neuronal etiquetado) para visualizar los resultados, generalmente de 2 a 3 días después de la entrega.

Cuando las partículas se recubrieron con netrina dsRNA, que han causado claramente visible derribo de expresión netrina que sólo ocurrió en las células que contienen partículas (normalmente, 1-2 partículas por célula). Partículas recubiertas con un plásmido EGFP fluorescencia inducida por la codificación en las células neuronales cuando se detuvieron en sus núcleos.

Protocol

Las partículas pueden ser recubiertas con reactivos diferentes, como las moléculas de dsRNA, plásmidos de ADN o los tintes. El tipo y diámetro de las partículas son elegidos de acuerdo con el reactivo y la profundidad de las células diana en el tejido: las partículas más grandes penetrar más, pero puede causar algún daño a los tejidos.

1. Preparación de las partículas recubiertas dsRNA

  1. Colocar el 100% de isopropanol en hielo.
  2. Volver a suspender las partículas de oro de 5 mg (S1600ri, Seashell Technology, LLC, diámetro promedio de 1,6 micras) en 100 ml de tampón de unión. Cuando la solución está lista, continúe con el siguiente paso.
  3. Diluir la solución de partículas mediante la adición de 100 l de tampón de unión, agitar brevemente y sonicar durante 1-2 minutos para evitar la formación de grumos.
  4. Añadir 5-10μg de dsRNA / siRNA (dsRNAs / siRNA debe ser disuelto en agua a una concentración de ~ 1μg/μl).
  5. Vortex y dejar a temperatura ambiente durante 2 min. Estos resultados intervalo de concentración y tiempo de siRNA saturado de partículas de oro.
  6. Se precipitan los complejos de partículas siRNA / oro por centrifugación a aproximadamente 2.500 rpm en una centrífuga de sobremesa de ~ 15 seg.
  7. Eliminar el sobrenadante y añadir con cuidado 750 ml de isopropanol frío con una mínima interrupción de la pastilla. Girar brevemente y eliminar el sobrenadante.
  8. Resuspender las partículas de oro en 100 l de isopropanol frío 100%, entonces tratar brevemente con ultrasonidos en un baño de ultrasonido (2-3 pulsaciones) para romper aglomerados de partículas. Por último, vierta las partículas en suspensión en un portaobjetos de vidrio y dejar secar a temperatura ambiente.

2. Preparación del montaje experimental para un ensayo específico

  1. Cada arma tiene un diámetro de boquilla de apertura diferentes, que van desde un mínimo de 50 micras hasta ~ ~ 3 mm. Los objetivos específicos que se utilizarán para la pistola por lo tanto, es elegido de acuerdo con el área de tejido se debe dirigir.
  2. Él la presión se ajusta a la profundidad en el tejido de las células diana, por lo general hasta ~ 100μm (presiones más altas pueden entregar las partículas más profundo). La distancia entre el embrión y la punta de la boquilla también afecta a la profundidad de penetración, como el oro impulso partículas sueltas en el aire.

3. Cargar el arma con las partículas pre-recubiertos

Las partículas deben ser cargados en forma de polvo seco en las líneas de tubo Tygon de inyección de partículas conectadas al colector. Esta tubería, que debe mantenerse en una atmósfera seca a 4 ° C cuando no se utilice, puede ser re-utilizados en experimentos adicionales con los mismos reactivos. Nuestra configuración experimental puede proporcionar hasta dos reactivos diferentes para cada ensayo a través de los puertos por separado en el múltiple.

  1. Raspar las partículas secas de la cubierta de cristal se desliza con el borde de una hoja de cubierta de vidrio o una cuchilla de afeitar antes de cargarlos en la línea de tubería de Tygon. Este tubo Tygon será específica sólo para este reactivo para evitar la contaminación cruzada.
  2. A medida que la carga de las partículas, doblar la tubería en forma de U cerca del conector, para mantener las partículas se propaguen a lo largo de toda la tubería y se concentra cerca del conector. Recoger las partículas con una pequeña espátula o un trozo de papel doblado peso y la carga cerca de la mitad de ellos en el tubo de cada serie de los embriones. Toque en la tubería durante el paso de carga a esparcir las partículas de manera uniforme.

4. Preparación de los animales

Antes y después de la entrega de partículas de oro, los embriones se mantienen en agua estéril estanque artificial a temperatura ambiente.

  1. Colocar los embriones, hasta la parte ventral, en una ranura tallada en un piso, 5 mm de espesor, piezas de caucho de silicona (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) y anestesiar a ellos en una solución de 8% de etanol en agua estéril estanque artificial ( embriones más jóvenes en las etapas E6-E8 puede permanecer en el agua de un estanque artificial sin etanol en todo el experimento).
  2. Inmediatamente antes de disparar las partículas, menor es el nivel de baño para descubrir la cara ventral de los embriones mediante la eliminación de parte de la solución. Coloque un pedazo de papel de seda con un pequeño agujero en el centro en la parte superior de ella para estabilizar y mantener la superficie se seque.

5. La entrega de las partículas recubiertas en el tejido diana

Una carga de partículas que se utiliza normalmente para un máximo de diez tiros, con un solo disparo por lo general la entrega del orden de unos pocos cientos de partículas.

  1. Generar un tiro de apertura de una de las válvulas de 0,3 s, lo que la inyección de un bolo de partículas desde la línea de tubería correspondiente a la pistola.
  2. Toque el tubo suavemente entre las tomas para desalojar las partículas de la pared de la tubería y así facilitar su inyección en el flujo de El de la pistola.
  3. Para cubrir el área de tejido de interés, las inyecciones múltiples pueden ser necesarios.
  4. Después de la entrega de las partículas, colocar los embriones de nuevo en agua de un estanque artificial, preferentemente de un embrión por pocillo en una placa de pozos múltiples.

6. Inmunotinción y etiquetado neuronal

Mantener los embriones a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 1 a 3 días después de la entrega de las partículas, hasta el RNAi (o la expresión ectópica) se logra. A continuación, llevar a cabo uno de los siguientes procedimientos en las muestras experimentales y controles:

  1. La hibridación in situ para analizar la presencia o ausencia de ARNm Netrin. Marcada con digoxigenina sanguijuela riboprobes netrina se hibridan con embriones sanguijuela conjunto.
  2. Inmunocitoquímica para el ensayo de proteínas Netrin y otras proteínas que son únicas en el tejido neuronal (por ejemplo, contra la tubulina acetilada). El procedimiento se realiza también en todo el montaje embriones.
  3. Microinyecciones de colorantes lipofílicos (DII y Dio) en las neuronas individuales, de tinte llena para etiquetar los cenadores completa de las neuronas de interés (neuronas mechanosensory presión en nuestro caso) en los segmentos tratados y los controles. Este ensayo se realiza sobre embriones vivos (intacto o disecados).

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Discussion

En esta demostración, se utilizó la pistola neumática capilar para proporcionar partículas de oro en las células de pequeño volumen localizada de un embrión vivo sanguijuela con knock-in y knock-down genes. La región de destino por lo general tenía un diámetro de ~ 150 micras y las partículas se encontraron unos 15 m alrededor de la profundidad de la penetración media, que se puede ajustar entre 0 y 50 micras. Cuando las partículas se recubrieron con moléculas de dsRNA de la netrina factor de orientación axón, que han causado claramente visible derribo de expresión netrina que sólo ocurrió en las células que contienen las partículas. Partículas recubiertas con un plásmido GFP fluorescencia inducida por la codificación en las células neuronales cuando se detuvieron en sus núcleos.

Hemos mostrado cómo la pistola neumática capilar ofrece la técnica de entrega biolística una nueva capacidad, para dirigirse a las regiones microscópicas de un tejido confinados en tres dimensiones y dirigido con gran precisión, sin dañar detectable en el tejido.

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Acknowledgements

Nos gustaría agradecer al Dr. Michael Baker por su ayuda en la generación de las construcciones de genes knock-in y para proporcionar las películas con lapso de tiempo de crecimiento proyecciones sensoriales. También nos gustaría agradecer a Virginia Vandelinder de asistencia técnica con los experimentos de neumáticos arma de fuego.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
gold particles Other Seashell Technology, LLC S1600ri
binding buffer Reagent Seashell Technology, LLC
silicone rubber Reagent Dow Corning Sylgard 184

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References

  1. Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
  2. Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
  3. Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
  4. Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
  5. Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Applied Physics Letters. 87, 014103- (2005).
  6. Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).

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