本地化的RNAi和药用水蛭异位基因表达

Biology

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Summary

在这个视频中,我们展示一个准确的枪法交付到现场组织了一种新型微型基因枪试剂的过程。我们撞倒在水蛭胚胎提供腹侧体壁和神经节单节段双链RNA分子的轴突导向分子Netrin的表达。

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Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech. J. Vis. Exp. (14), e697, doi:10.3791/697 (2008).

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Abstract

在这个视频中,我们展示的气动毛细血管枪使用的试剂准确的枪法交付到现场组织。我们扰乱基因表达模式在使用过程水蛭胚胎选择的细分,使内部控制未经处理的部分。

毛细管气动枪可用于开放的标本,在发展初期没有达到内部的细胞层。作为本地化的物质引入活组织法,基因枪与枪的交付有几个优点:它是快速,无接触式和非破坏性的。此外,一个单一的毛细血管枪,可用于不同物质的独立交付。配送区域〜50-150微米〜15微米,横向尺寸和延伸,各地的平均穿透深度,这是0和50微米之间可调。这次交付的优点是能够在选定的位置之间的单细胞,通过显微注射和全身击倒通过胞注射或通过遗传方法敲下来中间目标的细胞数量有限。

对于撞倒或敲在轴突导向分子Netrin,这自然是一些中央神经元和腹侧体壁的表达,但不背域的表达,我们提供的双链RNA分子或质粒DNA和体壁中央神经节。此过程包括以下步骤:(一)编制的一个特定的检测实验的设置(调整加快的压力),(二)涂层与双链RNA或DNA分子的颗粒,(三)包覆颗粒装入枪,在一个实验中,(四)两个试剂准备粒子传递,传递到靶组织(体壁或神经节)(V)的包覆颗粒的动物,及(vi)处理的胚胎(免疫,免疫组织化学和神经元标签)以可视化的结果,通常交货后2至3天。

当粒子被涂netrin双链RNA,它们造成明显可见netrin的表达,只有在含有颗粒的细胞(通常情况下,每单元1-2颗粒)发生击倒。粒子涂在神经细胞中的质粒编码EGFP的诱导荧光,当他们停止在其原子核。

Protocol

粒子可涂用不同的试剂,如双链RNA分子,DNA质粒或染料,。颗粒的类型和直径的选择根据试剂和在该组织的目标细胞:较大的粒子渗透进一步深入,但可能会导致某些组织损伤。

1。 dsRNA的包覆颗粒的制备

  1. 将冰异丙醇100%。
  2. 悬浮5毫克的金粒子(S1600ri,贝壳科技有限责任公司;平均直径为1.6微米),在结合缓冲液100毫升。当解决方案已准备就绪,继续下一步。
  3. 粒子的溶液稀释,加入100μL结合缓冲液,涡旋简要超声1-2分钟,以避免结块。
  4. 新增的双链RNA / siRNA的5 -10μg(dsRNAs / siRNA的应该是溶解在水中的浓度〜1μg/μl)。
  5. 涡,在室温下离开2分钟。这些siRNA的浓度和时间间隔的结果饱和的金粒子。
  6. 〜2500 RPM〜15秒,在板凳离心机离心沉淀的siRNA /金颗粒物。
  7. 去除上清,轻轻地添加750毫升冷异丙醇的颗粒最小的中断。旋转片刻,去除上清。
  8. 重悬于100μL冷100%异丙醇的金颗粒,然后超声简要洗澡sonicator(2-3次)打破颗粒结块。最后,倒入一个载玻片上,悬浮颗粒,并允许在室温下干燥。

2。准备一个特定的检测实验装置

  1. 每门炮有不同的喷嘴孔径,从最低〜50μm的范围〜3mm的。因此,枪使用的具体是根据区域组织有针对性的选择。
  2. 他的压力调整为靶细胞组织的深度,一般可达〜100微米(较高压力下,可以提供更深的粒子)。胚胎和喷嘴头之间的距离也影响穿透深度,黄金微粒在空气中的松散的势头。

3。预涂颗粒装入枪

应加载到聚乙烯管粒子注入线连接的多种干粉颗粒。这种管材,应在干燥的气氛保持在4 ° C在不使用时,可在另外的实验与同一试剂重新使用。我们的实验装置,可以提供高达每检测到两个不同的试剂,通过在多方面的单独的端口。

  1. 干刮玻璃包覆颗粒幻灯片使用的玻璃盖玻片或刀片的边缘,再装入聚乙烯管行。这聚乙烯管将具体仅此试剂,避免交叉污染。
  2. 正如你所负载的粒子,管,弯曲成U形连接器接近,以防止颗粒沿整个管和集中​​靠近连接器的蔓延。拿起一个小压舌板或一块折叠权衡纸的颗粒,每个系列的胚胎管装入其中的一半左右。点选在加载的步骤传播颗粒均匀油管。

4。动物的制备

之前和之后的金粒子交付,胚胎保存在无菌人工池塘里的水在室温下。

  1. 将胚胎腹侧,到一个单位,5mm厚的硅橡胶(Sylgard 184,道康宁,美联,心肌梗死)的一块刻一个槽,麻醉在8%的乙醇在无菌的人工池塘水的解决方案(年轻的胚胎可以保持整个实验阶段E6 - E8)在人工池塘里的水,没有乙醇。
  2. 立即拍摄前的颗粒,降低浴水平,发现胚胎的腹面删除解决方案的一部分。放置了一块纸巾,在它的上面,在中间切了一个小洞,以稳定并保持其表面干燥。

5。包覆颗粒配送到目标组织

粒子负载通常可以用十个镜头,与单杆通常提供几百个粒子的顺序。

  1. 生成射击0.3秒的阀门打开,造成颗粒进入​​相应的管枪线丸注入。
  2. 塔的镜头之间的油管轻轻打跑从管壁的颗粒,从而促进其注射到他的枪流。
  3. 为了利益的组织覆盖的面积,可能需要多个镜头。
  4. 粒子交付后,放入人工池塘里的水,最好是每口井的胚胎的胚胎早在一个多孔板。

6。免疫染色和神经元的标签

粒子交付后1至3天,保持室温在黑暗中的胚胎,直到实现RNA干扰(或异位表达)。然后,我们进行的实验标本和控制下列程序之一:

  1. 在原位杂交检测Netrin mRNA的存在或缺乏。地高辛标记的水蛭netrin riboprobes杂交整个水蛭胚胎。
  2. 免疫细胞化学检测Netrin蛋白和其他蛋白质,这是独一无二的神经组织(如抗乙酰化微管蛋白) 。执行过程也对整个安装胚胎。
  3. Microinjections的亲脂性染料 (DII和DIO)到单个神经元的染料填充到标签的神经元的利息,在处理和控制段(mechanosensory压力在我们的例子中神经元)的完整的乔木。这个实验是活胚胎(完好或解剖)。

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Discussion

在这个演示中,我们用毛细管气动枪提供金粒子进入细胞,在一个活的水蛭胚胎的本地化体积小敲,敲除基因。目标区域一般有一个直径150微米的颗粒〜15微米左右的平均穿透深度,这是在0和50微米之间可调。当粒子与双链RNA分子的轴突导向因子netrin涂层,它们造成明显可见netrin的表达,只有在含有颗粒细胞发生击倒。粒子涂在神经细胞中的质粒编码绿色荧光蛋白诱导荧光,当他们停止在其原子核。

我们已经表明你毛细管气动枪如何给一个新功能的基因枪交付技术,目标局限在三个层面,一个组织有针对性的高精密显微地区没有检测到损坏的组织。

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Acknowledgements

我们想感谢他的帮助下,在生成的基因结构,基因敲除,并提供不断增长的感觉预测的时间推移电影迈克尔贝克博士。我们还要感谢弗吉尼亚Vandelinder与气动枪的实验技术援助。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
gold particles Other Seashell Technology, LLC S1600ri
binding buffer Reagent Seashell Technology, LLC
silicone rubber Reagent Dow Corning Sylgard 184

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References

  1. Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
  2. Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
  3. Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
  4. Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
  5. Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Applied Physics Letters. 87, 014103- (2005).
  6. Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).

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