一个人脑组织中的染色质含量

Biology

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Summary

直到最近,表达对人类大脑的研究仅限于RNA或蛋白质的定量。本文中所描述的染色质免疫沉淀技术,将有可能映射在死后大脑基因表达的组蛋白甲基化和其他后生监管。

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Matevossian, A., Akbarian, S. A Chromatin Assay for Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (13), e717, doi:10.3791/717 (2008).

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Abstract

慢性神经精神疾病如精神分裂症,双相情感疾病和自闭症被认为是导致从遗传和环境因素可能会导致基因表达和其他分子病理学遗传学改变相结合。然而,传统上,死后大脑中的表达研究局限于基因或蛋白质的量化。在死后大脑的研究,如在自溶时间的可变性和组织integrities中遇到的限制也可能会影响到任何高阶的染色质结构研究。然而,基因组DNA的核小体的组织,包括的DNA:核心组蛋白具有约束力 - 看来主要是由不同的大脑银行提供的有代表性的样品保存。因此,它是研究在死后大脑中定义的基因位点的核心组蛋白的甲基化模式和其他共价修饰。在这里,我们提出一个简化的本地冻结(从来没有固定的)人类的大脑标本的染色质免疫沉淀(NChIP)协议。微球菌核酸酶的消化脑组织匀浆开始,NChIP由qPCR的三天之内就可以完成。这里介绍的方法应该是有用的,以澄清在正常和病变的人类大脑基因表达的表观遗传机制。

Protocol

程序:

第一

1。均质与Douncing缓冲区50-500毫克冷冻验尸报告灰色的事情组织。

!注意-人体组织必须谨慎处理,严格的安全条件下。它应在BSL - 2或更高的安全标准来处理。

  1. 以前解剖,验尸报告的大脑从-80 °,dounce Douncing缓冲区5X大脑体积,并在2.0 ml离心管地方。匹配的样品,并控制对同时处理。

2。微球菌核酸(MN)消化

  1. 添加微球菌核酸5U/mL移液器放置在冰之前的向上和向下混合样品,并在解决方案。
    *关键的一步-重要的是迅速地做到这一步,因为MN具有行动能力,甚至4 ° C 。
  2. 孵育7分钟样品在37 ° C。
  3. 7分钟的潜伏期后,加入0.5M EDTA浓度为10mm,停止MNase活动。

3。 Hypotonisation

  1. 将样品成15毫升猎鹰管。添加10X的样本量为0.2mm EDTA,1 / 2000苯甲脒0.2M和0.1M phenylmethanesulphonylfluoride 1 / 1000的样本量(PMSF)的样本量。后两个化合物被用作蛋白酶抑制剂。
    * 关键的一步-重要的是要在所有这些步骤的样品置于冰上。
  2. 孵育1小时的样品,而震荡每隔10分钟。
  3. 小时的潜伏期长,加上1 / 2000 3M数码地面电视的样本量,但另一种蛋白酶抑制剂。
  4. 涡样品再次离心10分钟,在3175离心力在4 ° C
    *可选步骤-与蛋白质G琼脂糖Precleansing。
    1. 取上清液,并提出在新的15毫升猎鹰管。
    2. 添加500μL蛋白G琼脂糖。
    3. 在室温为30分钟旋转。
    4. 在10分钟4000转离心4 ° C。
  5. 分发上清液500μL,使输入控制(只含有基因组DNA),和其余的是分裂成两个含1600μL的样品每管 - 染色质免疫沉淀(ChIP)样品。
  6. 输入控制是摆在-80 ° CO / N,直到进一步使用。
  7. 对芯片样品 - 1:10体积10​​XFSB和4μg的抗体,然后涡样品添加和旋转4 ° C过夜。
    !小心-金额和抗体稀释可能需要优化。

第二

!注意! -开始第二日通过洗涤将用于隔离核小体DNA的蛋白G琼脂糖。由于琼脂糖珠是非常敏感的,它是要切断时移液含有琼脂糖珠的任何解决方案的提示元首。

1。探测DNA的蛋白G琼脂糖珠

  1. 添加1.6 mL的1XFSB 245μL的G蛋白琼脂糖在2 ml离心管(足够4管)(循环)。
  2. 分成两个2 mL管和填充每个1X外频高达1.6毫升的解决方案。
  3. 在室温下旋转30秒和0.1离心力离心30秒。
  4. 去除上清液,用真空。
  5. 再次加入1.6毫升1X FSB。旋转的样品为30秒,然后在0.1离心力离心30秒。
  6. 再次取出上清,并结合1.5毫升1XFSB都管。
  7. 加入15μL超声鲑鱼精子DNA(10mg/ml的)。
    !注意-这一步,原则上应减少非特异性的免疫沉淀结合珠。然而,这也可能导致误报(人类)的DNA序列。
  8. 在室温下旋转30分钟,然后0.1离心力离心30秒。
  9. 去除上清。添加200μL1XFSB。
  10. 添加到每个芯片样品90μL琼脂糖珠。在4 ° C为1小时旋转。
  11. 添加到剩余的琼脂糖珠1XFSB 1ML作为阴性对照和旋转4 °为1小时。
  12. 后一小时的潜伏期长,0.1离心力离心30秒的样品和阴性对照。上清液。

2。洗衣机的珠子

!注意! -洗涤缓冲液必须保持在4℃直至使用,并要使用只有不到一个月以前。

  1. 珠每个洗涤液中加入1 mL和旋转,在室温下3分钟。
  2. 0.1离心力离心30秒。
  3. 弃上清采用真空。

*每个洗涤液

- 低盐洗涤液

- 高盐洗涤液 -氯化锂溶液- 在室温下1分钟只旋转!

- TE缓冲液(10毫米的Tris,1 mM EDTA的pH值= 8)

3。洗脱

*关键的一步 -每一天的实验,它是被用来新鲜的洗脱液。

  1. 每个样品加入250μL新鲜配制洗脱缓冲液。
  2. 旋转在室温为15分钟,然后离心1分钟,在0.4离心力。
  3. 保存在2.0毫升的离心管(环)上清。
  4. 洗脱缓冲液中加入250μL到几秒钟,每个样品由专人旋涡。然后,在mulitvortexer 15分钟的旋涡的样品。
  5. 在16个区域合作框架RPM离心4分钟,并保存在相同的2.0毫升管(环)上清。

4。消化蛋白质

  1. 加入10微升0.5M EDTA,25微升0.8M的Tris - HCl,pH值6.5,10毫克/毫升的蛋白酶K(1 / 200采样),每个芯片的样品。
  2. 每个输入控制,裂解液中加入蛋白酶K消化(样品缓冲液的1 / 10)和10mg/ml的蛋白酶K(样品缓冲液的1 / 200)。
  3. 输入和芯片样品在52℃孵育至少3小时。

5。酚/氯仿抽提

引擎盖下的注意-实验要求的酚/氯仿,应当执行。使用丁腈手套时,酚/氯仿。

  1. 3个小时的潜伏期后,我们每个样品中加入500μL酚 - 氯仿。
  2. 涡所有样品几秒钟,然后离心5分钟的转速在13个区域合作框架。
  3. 在这一点上,分两个阶段将是现在和我们的顶级阶段的内容感兴趣。取出顶部阶段,并放入一个2 ml离心管。
  4. 每个样品1.375毫升100%的乙醇添加2μL糖原和50μL3M的醋酸钠的混合物。
  5. 涡所有样品的蓬勃发展。放置在-80 ° C过夜。

第三

  1. 取出样品的形式-80℃,并置于冰上他们解冻。
  2. 10分钟在15离心力离心4 ° C。
  3. 小心取出上清液,在试管底部,而不会干扰沉淀。
  4. 每个样品中加入1毫升75%冷乙醇,然后反转的4-6倍。
  5. 5分钟在18离心力离心4 ° C。
  6. 去除上清液,再一次,并允许空气干燥的颗粒。
  7. 干颗粒溶解于50μL的Tris - HCl,PH8 4MM和储存在-80 ° C,直到进一步的使用。

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Discussion

这里列出的协议在人类大脑的组蛋白和/或DNA甲基化签名感兴趣的调查是非常有用的的,因为这些染色标记可能不容易死后文物相比,其他类型的修改,包括(组蛋白)的乙酰化和磷酸化1的, 2。死后的大脑,是适合单核小体的准备的研究,在很大程度上仍然连接到核心组蛋白的DNA,至少在与代表自溶的时间间隔(死亡和冻结/储存组织之间的时间)范围内的典型标本,几个小时至1.5天。然而,单核小体的准备,可以在核小体的定位和密度的变化敏感,特别围绕周围3基因的转录起始位点的序列。因此,修改独立的抗组蛋白抗体的对照实验应包括在内。另外,它可能会孤立于人类的大脑中提取的聚核小体的组分,使用较短的孵育时间与额外的纯化步骤,微球菌核酸酶消化(包括离心)。最后,在最近的全基因组转录因子在死后脑组织有约束力的研究通过简单剪切超声4染色质。值得注意的是,固定前超声或酶的消化的制备染色质可能无法从尸检研究的角度来看理想选择,因为崩溃和/或高阶死亡后的染色质结构的人工重新配置是难以控制的潜在混淆。因此,死后大脑芯片检测包括核小体的核心紧紧地贴到基因组DNA的组蛋白和其他蛋白质的分子的数量有限,可能是有用的。即使考虑到这个警告,在此演示文稿中概述的方法有可能在正常和病变的人类大脑的神经元和胶质细胞的功能的染色质相关机制提供新的见解。

我们已经使用这种技术的成功,主要用于测量在使用基因通过基因的qPCR 1,5,6特异性启动子的组蛋白甲基化和组蛋白占有率。如前所述,人类死后的大脑似乎是适合单核小体的准备的研究,因为在很大程度上仍然连接到核心组蛋白的DNA。通常情况下,75毫克人类的儿童或者成人大脑皮质(灰质)开始时,人们可以期待使用提出的协议,上述收益率在20-30毫微克/μL,在50μL总体积为输入10-15纳克/μL的芯片总体积50μL,至少在修改的具体抗组蛋白抗体。所谓的芯片投入比率是度量单位。监测熔解曲线分析,凝胶电泳和测序反应的特异性。此外,阴性对照(一)缺乏特异性抗体或(二)含(非特异性免疫球蛋白)应平行的芯片和输入样本的qPCR处理,而不应导致在具体的产品。要知道,鲑鱼的精子作为阻断剂使用时,控制样品可能导致在涂抹凝胶运行时。

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Acknowledgements

这项工作是从美国国立精神卫生研究所(5R01MH071476)的赠款支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-HCl EMD Millipore 9310
Magnesium Chloride Hexahydrate OmniPur, EMD Millipore 5980
Calcium Chloride Fisher Scientific C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 OmniPur, EMD Millipore 4055
Sodium Chloride Mallinckrodt Baker Inc. 7581-06
SDS Solution 10% (w/v) Bio-Rad 161-0416
Triton X-100 Fluka 93426
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I-3021
Sodium Deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-25G
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650-100G
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous) Sigma-Aldrich S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus Sigma-Aldrich N3755-200UN
Benzamidine Fluka 12072
Phenylmethanesulfonylfluoride Sigma-Aldrich P7626-1G
3M DTT Fluka 43815
Protein G Agarose, Fast Flow Upstate, Millipore 16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit Stratagene, Agilent Technologies 201190
Proteinase K from Engyodontium album Sigma-Aldrich P2308
Phenol:Chloroform 1:1 OmniPur, EMD Millipore 6810
Glycogen, From Mussels Sigma-Aldrich G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof) Pharmco-AAPER 111000200

Solutions:

  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.

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References

  1. Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.
  2. Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters. J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.
  3. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, 76-82 Forthcoming.
  4. Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain. Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.
  5. Huang, H. uang, Akbarian, S. GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia. PLoS ONE. 2, Forthcoming.
  6. Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain. J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.

Comments

3 Comments

  1. Dear Dr, I am selvakumar, Research scholar, Dept of Endocrinology,University of madras, chennai- India. I Need aclarification, whether is is possible in the rat brain. Send some assay, protocol in brain regions, thanking you, with regards selvakumar 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 21, 2008 - 9:25 AM
  2. Hi, What company did you purchase the tissue homogenizer from for douncing the brain tissue? Thanks, Pritika

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2009 - 10:19 PM
  3. Hi, Pritika, The tissue homogenizer is a Wheaton Science Product. We purchased from Fisher Scientific. Thank you. Yan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 7, 2009 - 9:29 AM

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