İnsan Beyninin Doku Kromatin Testi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Yakın zamana kadar, insan beyni ifade çalışmaları RNA veya protein ölçümü ile sınırlı kalmıştır. Bu yazıda anlatılan kromatin immunoprecipitation teknikleri, postmortem beyin gen ekspresyonu histon metilasyon ve diğer epigenetik düzenleyiciler haritaya mümkün olacaktır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Matevossian, A., Akbarian, S. A Chromatin Assay for Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (13), e717, doi:10.3791/717 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

, Şizofreni, bipolar hastalığı ve otizm gibi kronik nöropsikiyatrik hastalıklar, gen ekspresyonu ve diğer moleküler patoloji epigenetik değişikliklere neden olabilir genetik ve çevresel faktörlerin bir kombinasyonu sonucu olduğu düşünülmektedir. Geleneksel olarak, ancak, postmortem beyin ifade çalışmaları mRNA ya da protein ölçümü hapsedildi. Otoliz ve doku bütünlükleri içinde değişkenlikler gibi postmortem beyin araştırmalarında karşılaşılan sınırlamalar da yüksek mertebeden kromatin yapıların herhangi bir çalışma etkisi muhtemeldir. Ancak, DNA da dahil olmak üzere, genomik DNA nucleosomal kuruluş: bağlayıcı çekirdek histon -, çeşitli beyin bankaları tarafından sağlanan temsili numuneler büyük ölçüde korunmuş olması görünür. Bu nedenle, metilasyon desen ve postmortem beyin tanımlanan genomik lokusların çekirdek histon diğer kovalent modifikasyonlar incelemek mümkündür. Burada, dondurulmuş (sabit asla) insan beyninin örnekler için basitleştirilmiş yerli kromatin immunoprecipitation (NChIP) protokolü mevcut. Beyin homojenatlarında micrococcal nükleaz sindirim ile başlayarak, NChIP qPCR izleyen üç gün içinde tamamlanabilir. Burada sunulan metodoloji, normal ve hastalıklı insan beyninin gen ekspresyonunun epigenetik mekanizmaları aydınlatmak için yararlı olacaktır.

Protocol

Prosedür:

1. Gün

1. Tampon Douncing 50-500 mg donmuş post-mortem gri madde doku homojenize edilir.

! DİKKAT! İnsan doku sıkı güvenlik koşulları altında itina ile ele alınması gerekir. BSL-2 ya da daha yüksek güvenlik standartları ele alınmalıdır.

  1. Önceden disseke, post-mortem beyin alın -80 ° C Douncing Tampon 5X beyin hacmi Dounce, ve 2.0 mL mikrosantrifüj tüp yer. Örnek eşleştirilmiş ve kontrol çiftleri eş zamanlı olarak işlenir.

2. Micrococcal Nükleazlar (MN) Sindirim

  1. Örnek Micrococcal nuclease 5U/mL ekleyin ve buz üzerinde yerleştirmeden önce yukarı ve aşağı pipetleme çözüm içinde karıştırın.
    * KRİTİK ADIM - MN hatta 4 hareket etme yeteneği bu yana hızlı bir şekilde bu adımı önemlidir ° C'dir
  2. 37 7 dakika inkübe örnekleri ° C.
  3. 7 dakika inkübasyondan sonra, MNase faaliyeti durdurmak için 10mM bir konsantrasyonu 0,5 M EDTA ekleyin.

3. Hypotonisation

  1. Yeri örnekleri 15 ml şahin tüpe. 0.2mm EDTA, 1 / 2000 numune hacmi 0,2 M benzamidine ve 1 / 1000 0.1M phenylmethanesulphonylfluoride örnek hacmi (PMSF) 10X numune hacmi ekleyin. Son iki bileşikler proteaz inhibitörleri olarak kullanılır.
    * KRİTİK ADIM - Tüm bu aşamalar sırasında buz örnekleri tutmak için önemlidir.
  2. Her 10 dakikada bir vorteks ise, 1 saat için örnek inkübe edin.
  3. Saat süren inkübasyon sonunda, 1 / 2000 3M DTT örnek hacmi, henüz başka bir proteaz inhibitörü ekleyin.
  4. Vorteks örneği bir kez daha ve 4 ° C'de 10 dakika için 3175 RCF santrifüj
    * OPSİYONEL ADIM - Protein G Agaroz Precleansing.
    1. Supernatant alın ve yeni 15 ml şahin tüp yerleştirilir.
    2. Protein G Agaroz 500 mcL ekleyin.
    3. Oda sıcaklığında 30 dakika çevirin.
    4. 10 dakika 4000 rpm'de Santrifüj 4 ° C
  5. 500 mcL Giriş kontrolü (tek genomik DNA içeren) olarak kullanılır supernatant dağıtın, böylece, geri kalan 1600 mcL içeren örnek her iki tüp bölünmüş - kromatin immunoprecipitation (ChIP) numuneler için.
  6. Giriş kontrolü -80 yerleştirilir ° CO / N daha sonra kullanmak kadar.
  7. ChIP örnekleri sonra antikor 10XFSB ve 4μg 01:10 hacmi, vorteks örnekleri ekleyin ve 4 ° C gecede onları döndürmek.
    ! DİKKAT! Antikor miktarı ve seyreltme optimizasyonu gerekebilir.

2. Gün

! DİKKAT! 2. Gün - nucleosomal DNA izole etmek için kullanılır olacak Protein G Agaroz yıkayarak başlayın. Agaroz boncuklar çok hassas olduğundan, agaroz boncuklar içeren herhangi bir çözüm pipetleme zaman ipuçları başlarını kesmek için gereklidir.

1. DNA Protein G Agaroz Boncuk problama

  1. 245 mcL protein, 2 ml mikrosantrifüj tüp içinde G-agaroz (4 tüpler için yeterli) (loop) 1.6 mL 1XFSB ekleyin.
  2. Iki 2 ml tüpler ve dolum 1X FSB ile her 1.6 ml kadar çözüm ayırın.
  3. RT 30 saniye çevirin ve 30 saniye için 0.1 RCF santrifüj.
  4. Bir vakum kullanarak süpernatantı.
  5. Tekrar 1.6 ml 1X FSB ekleyin. 30 saniye süreyle örnekleri çevirin ve 30 saniye için 0.1 RCF santrifüj sonra.
  6. Süpernatantı tekrar çıkarın ve 1,5 mL 1XFSB ile her iki tüpte birleştirmek.
  7. 15 mcL sonicated Salmon Sperm DNA (10mg/ml) ekleyin.
    ! DİKKAT! Bu adım, ilke olarak, boncuk immunoprecipitate non-spesifik bağlanma azaltmak gerekir. Ancak, bu da (insan) DNA dizilerinin bazı yanlış pozitif yol açabilir.
  8. RT Döndür, 30 dakika sonra 30 saniye için 0.1 RCF santrifüj.
  9. Süpernatantı. 1XFSB, 200 mcL ekleyin.
  10. Her ChIP örnek agaroz boncuk 90 mcL ekleyin. 1 saat 4 ° C'de döndürün.
  11. Negatif kontrol olarak hizmet veren ve 4 döndürmek ° C 1 saat kalan agaroz boncuk haline 1XFSB 1 ml ekleyin.
  12. Saat süren inkübasyondan sonra, 30 saniye için 0.1 RCF ve negatif kontrol örnekleri santrifüj. Süpernatantı atın.

2. Boncuk Yıkama

! DİKKAT! - Yıkama tamponlar 4 ° C kullanana kadar, eski bir aydan daha az olan, yalnızca kullanılmak üzere saklanmalıdır.

  1. Boncuklar her yıkama solüsyonu 1 ml ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika çevirin.
  2. 30 saniye için 0.1 RCF santrifüjleyin.
  3. Süpernatant kullanarak vakum atın.

* Her yıkama solüsyonu

- Düşük tuz yıkama tamponu

- Yüksek tuz yıkama tamponu - Lityum klorür solüsyonu - sadece 1 dakika boyunca RT döndürmek!

- TE tamponu (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8)

3. Elüsyon

* KRİTİK ADIM gününde her deney için kullanılacak taze Elüsyon Tampon olun.

  1. Her bir örnek için taze hazırlanmış elüsyon tampon 250 mcL ekleyin.
  2. RT 15 dakika döndürün, ardından 1 dakika süreyle 0.4 RCF santrifüj.
  3. Süpernatant, 2.0 ml mikrosantrifüj tüp (Loop) kaydedin.
  4. Birkaç saniye için el ile her bir örnek ve vorteks elüsyon tampon 250 mcL ekleyin. Daha sonra, 15 dakika boyunca bir mulitvortexer vorteks örnekleri.
  5. 4 dakika 16 RCF rpm'de santrifüj ve aynı 2.0 ml tüp (Loop) supernatant kaydetmek.

4. Digest Protein

  1. Her ChIP örnek 10 ul 0,5 M EDTA, 25 ul 0.8M Tris-HCl, pH 6.5, 10 mg / ml proteinaz K (1 / 200 örnek).
  2. Her giriş kontrol etmek için, proteinaz K sindirimi (örnek tampon 1 / 10) ve 10mg/ml Proteinaz K (örnek tampon 1 / 200) lizis tamponu ekleyin.
  3. 52 ° C giriş ve ChIP örnekleri en az 3 saat süreyle inkübe edin.

5. Kloroform / Fenol ekstraksiyonu

! DİKKAT! Deney fenol kloroform / gerektiren başlık altında yapılmalıdır. Kloroform / fenol işlerken nitril eldiven kullanın.

  1. 3 saat inkübasyondan sonra, her bir örnek için 500 ul fenol-kloroform ekleyin.
  2. Vortex birkaç saniye için tüm örnekler, daha sonra 5 dakika boyunca 13 RCF rpm'de santrifüj.
  3. Bu noktada, iki aşamada olacak ve üst faz içeriği ilgilenen. Üst faz çıkarın ve 2 mL mikrosantrifüj tüpe koydu.
  4. 1.375 mL% 100 Etanol ile birlikte her bir örnek, 3M sodyum asetat Glikojen ve 50μL 2μL karışımı ekleyin.
  5. Tüm örnekler şiddetle Vortex. ° C gece -80 yerleştirin.

3. Gün

  1. Kaldır örnekleri formu -80 ° C ve onları Çözülme için buz üzerine koyun.
  2. 10 dakika 15 RCF Santrifüj 4 ° C
  3. Tüpün dibinde pelet rahatsız etmeden dikkatlice supernatant çıkarın.
  4. Her bir örnek için 1 ml soğuk% 75 Etanol ekleyin, sonra onları 4-6 kez çevirin.
  5. 4 5 dakika boyunca 18 RCF santrifüjleyin ° C
  6. Bir kez daha süpernatantı ve pelet kurumaya bırakın.
  7. -80 50 4mm Tris-HCl, pH8 mcL ve mağaza kuru pelet çözülür ° C daha sonra kullanmak kadar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, burada özetlenen bu kromatin işaretler, postmortem eserler (histon) asetilasyonu ve fosforilasyon 1 de dahil olmak üzere diğer tür değişiklikler ile karşılaştırıldığında daha az eğilimli olabilir, çünkü insan beyninin histon ve / veya DNA metilasyon imzaları ilgilenen araştırmacılar için özellikle yararlı 2. Postmortem beyin mono-nucleosomal hazırlıkları çalışmaya müsait; aralığının tipik temsilcisi otoliz aralıklarla (ölüm ve donma / doku depolanması arasındaki zaman) ile en az örneklerinde DNA, büyük ölçüde çekirdek histon bağlı kalır birkaç saat kadar 1.5 gün 1. Ancak, özellikle genler 3 transkripsiyon başlangıç ​​siteleri çevreleyen dizileri etrafında mono-nucleosomal hazırlıkları nucleosomal konumlandırma ve yoğunluklar değişikliklere karşı duyarlı olabilir. Bu nedenle, değişiklik bağımsız anti-histon antikorlar ile kontrol deneyleri dahil edilmelidir. Alternatif olarak, ek saflaştırma adımları ile birlikte micrococcal nükleaz sindirmek için kısa inkübasyon süreleri kullanarak (Ultrasantrifügasyon dahil), insan beyninin özleri poli-nucleosomal fraksiyonları izole etmek mümkün olabilir. Son olarak, postmortem beyin bağlayıcı genom transkripsiyon faktörü üzerinde yeni bir çalışmada sadece sonikasyon 4 üzerinden kromatin makaslanmış. Özellikle, arıza ve / veya yapay ölümünden sonra yüksek mertebeden kromatin yapıları yeniden yapılandırılması, kontrol etmek için zor potansiyel boşa çünkü fiksasyon sonication veya enzim sindirimi önce kromatin hazırlanması, postmortem çalışmalar açısından ideal olmayabilir. Bu nedenle, postmortem beyin ChIP deneyleri nucleosomal çekirdek histon ve genomik DNA sıkıca bağlı diğer proteinler de dahil olmak üzere sınırlı sayıda molekülleri için yararlı olması muhtemeldir. Bu tanıtımı özetlenen yaklaşımları dikkate alınan bu uyarı ile bile nöronal ve glial normal ve hastalıklı insan beyninin işlevlerini yöneten kromatin ile ilişkili mekanizmalar yeni bakış açıları sağlamak için muhtemeldir.

Biz başarıyla öncelikle gen qPCR 1, 5, 6 gen kullanarak belirli promotorlerde histon metilasyon ve histon doluluk ölçmek için bu tekniği kullandım. Daha önce de belirtildiği gibi insan postmortem beyin, DNA, büyük ölçüde çekirdek histon bağlı kaldığından mono-nucleosomal hazırlıkları çalışmaya uygun görünüyor. Tipik olarak, 75 mg insan çocuk veya yetişkin serebral korteks (gri madde) ile başlarken, toplam hacmi 50 ul ul ng / Giriş ve 10-15 sunulan protokol yukarıda 20-30 verim bekleyebiliriz ul ng / ChIP ul 50 toplam hacmi, en az değişiklik spesifik anti-histon antikorlar kullanılır. Giriş oranı sözde ChIP ölçü birimidir. Reaksiyon özgüllüğü Erime eğrisi analizi, jel elektroforezi ve sıralama tarafından izlenir. Buna ek olarak, negatif kontroller (i) özel antikorlar eksik veya (ii) içeren (non-spesifik) immünglobulin qPCR ChIP ve Giriş örnekleri paralel olarak işlenecek ve belirli bir ürün neden olmamalıdır. Bir jel üzerinde çalıştırdığınızda, kontrol örnekleri somon sperm engelleyici bir ajan olarak kullanıldığında bir karalama neden olabilir farkında olun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü (5R01MH071476) bir hibe ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-HCl EMD Millipore 9310
Magnesium Chloride Hexahydrate OmniPur, EMD Millipore 5980
Calcium Chloride Fisher Scientific C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 OmniPur, EMD Millipore 4055
Sodium Chloride Mallinckrodt Baker Inc. 7581-06
SDS Solution 10% (w/v) Bio-Rad 161-0416
Triton X-100 Fluka 93426
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I-3021
Sodium Deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-25G
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650-100G
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous) Sigma-Aldrich S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus Sigma-Aldrich N3755-200UN
Benzamidine Fluka 12072
Phenylmethanesulfonylfluoride Sigma-Aldrich P7626-1G
3M DTT Fluka 43815
Protein G Agarose, Fast Flow Upstate, Millipore 16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit Stratagene, Agilent Technologies 201190
Proteinase K from Engyodontium album Sigma-Aldrich P2308
Phenol:Chloroform 1:1 OmniPur, EMD Millipore 6810
Glycogen, From Mussels Sigma-Aldrich G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof) Pharmco-AAPER 111000200

Solutions:

  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.
  2. Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters. J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.
  3. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, 76-82 Forthcoming.
  4. Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain. Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.
  5. Huang, H. uang, Akbarian, S. GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia. PLoS ONE. 2, Forthcoming.
  6. Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain. J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.

Comments

3 Comments

  1. Dear Dr, I am selvakumar, Research scholar, Dept of Endocrinology,University of madras, chennai- India. I Need aclarification, whether is is possible in the rat brain. Send some assay, protocol in brain regions, thanking you, with regards selvakumar 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 21, 2008 - 9:25 AM
  2. Hi, What company did you purchase the tissue homogenizer from for douncing the brain tissue? Thanks, Pritika

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2009 - 10:19 PM
  3. Hi, Pritika, The tissue homogenizer is a Wheaton Science Product. We purchased from Fisher Scientific. Thank you. Yan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 7, 2009 - 9:29 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics