Un ensayo de la cromatina de tejido cerebral humano

Biology

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Summary

Hasta hace poco, los estudios de expresión en el cerebro humano se limita a la cuantificación de ARN o de proteína. Con las técnicas de inmunoprecipitación de cromatina se describe en este artículo, será posible asignar metilación de las histonas y otros reguladores epigenética de la expresión génica en el cerebro postmortem.

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Matevossian, A., Akbarian, S. A Chromatin Assay for Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (13), e717, doi:10.3791/717 (2008).

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Abstract

Enfermedades neuropsiquiátricas crónicas como la esquizofrenia, enfermedad bipolar y el autismo se cree que el resultado de una combinación de factores genéticos y ambientales que podrían resultar en alteraciones epigenéticas de la expresión génica y otras patología molecular. Tradicionalmente, sin embargo, los estudios de expresión en el cerebro post mortem se limitaron a la cuantificación de ARNm o proteína. Las limitaciones encontradas en la investigación postmortem del cerebro tales como variabilidad en el tiempo y la autolisis integridades tejido también es probable que el impacto de los estudios de estructuras de orden superior de la cromatina. Sin embargo, la organización nucleosomal de ADN genómico como el ADN: núcleo de unión de histonas - parece ser preservado en gran medida en muestras representativas de los bancos diferentes del cerebro. Por lo tanto, es posible estudiar el patrón de metilación y otras modificaciones covalentes de las histonas en definir loci del genoma en el cerebro postmortem. A continuación, presentamos una versión simplificada nativos inmunoprecipitación de cromatina (NChIP) protocolo para muestras de cerebro congelado (no fijos) humanos. A partir de la digestión nucleasa micrococcal de homogeneizados de cerebro, NChIP seguido por qPCR se puede completar en tres días. La metodología que aquí se presenta debe ser útil para dilucidar los mecanismos epigenéticos de la expresión génica en el cerebro humano normal y enfermo.

Protocol

Procedimiento:

1 ª Jornada

1. Homogeneizar 50-500 mg de tejido congelado cuestión post-mortem gris con Douncing Buffer.

! PRECAUCIÓN - tejidos humanos deben ser manipulados con cuidado bajo condiciones de estricta seguridad. Se debe manipular a las normas de seguridad BSL-2 o superior.

  1. Tener previamente disecado, post-mortem de cerebros de los -80 ° C, los Dounce en el volumen cerebral de Buffer 5X Douncing, y el lugar en el tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Combinado de la muestra y el control de los pares se procesan simultáneamente.

2. Micrococcal nucleasa (MN) Digestión

  1. Añadir 5U/mL de micrococcal nucleasa de la muestra y la mezcla dentro de la solución con la pipeta de arriba a abajo antes de colocarlos en hielo.
    * Paso crítico - Es importante hacer este paso con rapidez ya que MN tiene la capacidad de actuar en hasta 4 ° C.
  2. Incubar las muestras durante 7 minutos a 37 ° C.
  3. Después de la incubación de 7 minutos, añadir 0,5 M EDTA a una concentración de 10 mM para detener la actividad MNase.

3. Hypotonisation

  1. Coloque las muestras en un tubo de 15 ml halcón. Añadir 10 veces el volumen de muestra de 0,2 mm EDTA, 1 / 2000 del volumen de muestra de benzamidina 0,2 M y el volumen 1 / 1000 de la muestra de phenylmethanesulphonylfluoride 0,1 M (PMSF). Estos dos últimos compuestos se utilizan como inhibidores de la proteasa.
    * Paso crítico - Es importante mantener las muestras en hielo durante todos estos pasos.
  2. Incubar la muestra durante 1 hora, mientras agitación cada 10 minutos.
  3. Al final de la incubación de una hora, agregar el volumen 1 / 2000 de la muestra de 3M TDT, un nuevo inhibidor de la proteasa.
  4. Muestra Vortex, una vez más y se centrifuga a 3175 rcf durante 10 minutos a 4 ° C.
    * PASO OPCIONAL - Precleansing con proteína G agarosa.
    1. Tomar el sobrenadante y poner en el nuevo tubo de 15 ml halcón.
    2. Añadir 500 l de proteína G agarosa.
    3. Gire a la temperatura ambiente durante 30 min.
    4. Centrifugar a 4000 rpm durante 10 min a 4 ° C.
  5. Distribuir sobrenadante para que 500 l se utilizó como control de entrada (que contiene el ADN genómico solamente), y el resto se divide en dos tubos con 1.600 l de cada muestra - que son de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) muestras.
  6. El control de entrada se sitúa en -80 ° CO / N hasta su posterior utilización.
  7. A las muestras de chip - añadir volumen 1:10 de 10XFSB y 4μg de anticuerpos, entonces vórtice las muestras y girarlas a 4 ° C durante la noche.
    ! ATENCIÓN - La cantidad y la dilución de anticuerpos puede requerir de optimización.

2 º día

! ¡CUIDADO! - Comience a 2 º día lavando la proteína G agarosa que se utiliza para aislar el ADN nucleosomal. Desde bolas de agarosa son muy sensibles, es necesario cortar las cabezas de las puntas de pipeta siempre cualquier solución que contiene perlas de agarosa.

1. Sondeo de la proteína G perlas de agarosa para ADN

  1. Añadir 1,6 ml 1XFSB a 245 l de proteína G-agarosa (suficiente para 4 tubos) en un tubo de microcentrífuga de 2 ml (loop).
  2. Separar la solución en dos tubos de 2 ml y llenar cada uno de hasta 1,6 ml con 1X FSB.
  3. Gire a temperatura ambiente durante 30 segundos y centrifugar a 0,1 RCF durante 30 segundos.
  4. Eliminar el sobrenadante con una aspiradora.
  5. Añadir 1,6 ml de 1X FSB, una vez más. Girar las muestras durante 30 segundos y luego se centrifuga a 0,1 RCF durante 30 segundos.
  6. Eliminar el sobrenadante, una vez más, y se combinan los dos tubos con 1,5 mL 1XFSB.
  7. Añadir 15 ul de ADN de esperma de salmón sonicado (10mg/ml).
    ! ATENCIÓN - Este paso se debe, en principio, reducir la unión no específica de la immunoprecipitate a las perlas. Sin embargo, esto también podría dar lugar a falsos positivos de algunas de las secuencias de ADN (humano).
  8. Gire a temperatura ambiente durante 30 minutos y centrifugar a 0,1 RCF durante 30 segundos.
  9. Eliminar el sobrenadante. Añadir 200 uL de 1XFSB.
  10. Añadir 90 l de bolas de agarosa en cada muestra de chip. Gire a 4 ° C durante 1 hora.
  11. Añadir 1 ml de 1XFSB en resto de bolas de agarosa para servir como un control negativo y girar a 4 ° C durante 1 hora.
  12. Después de la incubación de una hora, se centrifuga la muestra y el control negativo en el 0,1 RCF durante 30 segundos. Eliminar el sobrenadante.

2. Lavado de las Perlas

! ¡CUIDADO! - Buffers de lavado debe mantenerse a 4 ° C hasta su uso, y deben ser utilizados sólo si son menos de un mes de edad.

  1. Añadir 1 ml de cada solución de lavado hasta el talón y giran durante 3 min a temperatura ambiente.
  2. Centrifugar a 0,1 RCF durante 30 segundos.
  3. Desechar el sobrenadante con vacío.

* Cada solución de lavado

- Bajo la sal tampón de lavado

- Elevada de sal tampón de lavado - Solución de cloruro de litio - sólo girar a temperatura ambiente durante 1 minuto!

- Buffer TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8)

3. Elución

* Paso crítico - Hacer Tampón de Elución fresco para cada experimento el día en que se va a utilizar.

  1. Añadir 250 l de buffer de elución recién preparada para cada muestra.
  2. Girar durante 15 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 0,4 RCF durante 1 min.
  3. Guardar el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL (Loop).
  4. Añadir 250 l de tampón de elución de cada muestra y agitar con la mano durante unos segundos. Luego, las muestras de vórtice durante 15 minutos en un mulitvortexer.
  5. Centrifugar a 16 RCF rpm durante 4 minutos y guardar el sobrenadante en el mismo tubo de 2,0 mL (Loop).

4. Digerir las proteínas

  1. Añadir 10 l 0,5 M EDTA, 25 l 0,8 M Tris-HCl, pH 6,5, 10 mg / ml de proteinasa K (1 / 200 de la muestra) a cada muestra de chip.
  2. Para cada control de entrada, agregar solución amortiguadora de lisis para la digestión de proteinasa K (1 / 10 de tampón de muestra) y 10mg/ml proteinasa K (1 / 200 de tampón de muestra).
  3. Incubar de entrada y de muestras de chips de 52 ° C durante al menos 3 horas.

5. Fenol / cloroformo extracción

! PRECAUCIÓN - Experimento requieren fenol / cloroformo se debe realizar bajo el capó. Use guantes de nitrilo al manejar con fenol / cloroformo.

  1. Después de la incubación de 3 horas, le sumamos los 500 l de fenol-cloroformo a cada muestra.
  2. Vortex todas las muestras de varios segundos, luego se centrifuga a 13 rpm RCF durante 5 minutos.
  3. En este punto, dos fases estará presente y estamos interesados ​​en el contenido de la fase superior. Saque la fase superior y lo puso en un tubo de microcentrífuga 2 ml.
  4. Añadir una mezcla de 2μL de glucógeno y 50μL de acetato de sodio 3M para cada muestra, junto con 1,375 ml de etanol al 100%.
  5. Vortex todas las muestras de fuerza. Lugar en -80 ° C durante la noche.

3 º Día

  1. Extraer muestras de forma -80 ° C y los coloca en el hielo para que se descongele.
  2. Centrifugar a 15 RCF durante 10 minutos a 4 ° C.
  3. Retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento en el fondo del tubo.
  4. Añadir 1 ml de etanol frío al 75% para cada muestra, y luego invertir 4-6 veces.
  5. Centrifugar a 18 RCF durante 5 min a 4 ° C.
  6. Extraer el sobrenadante, una vez más y permitir que las pastillas se seque al aire.
  7. Disolver pellets secos en 50 l de 4 mm de Tris-HCl, pH 8 y se almacena a -80 ° C hasta su uso posterior.

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Discussion

El protocolo descrito aquí es particularmente útil para los investigadores interesados ​​en las firmas de metilación de las histonas y / o ADN del cerebro humano, ya que estas marcas de la cromatina puede ser menos propensa a los artefactos post-mortem, en comparación con otros tipos de modificaciones, incluyendo (histonas) acetilación y fosforilación 1, 2. El cerebro postmortem se presta al estudio de la mono-nucleosomal los preparativos, el ADN permanece en gran parte unido a las histonas centrales, al menos en las muestras con intervalos de autolisis representante (el tiempo entre la muerte y la congelación / almacenamiento de los tejidos) por lo general en el rango de varias horas hasta 1,5 días 1. Sin embargo, mono-nucleosomal preparativos podrían ser sensibles a los cambios en el posicionamiento nucleosomal y densidades, particularmente alrededor de secuencias en torno a los sitios de inicio de transcripción de los genes 3. Por lo tanto, los experimentos de control con la modificación independiente de anticuerpos anti-histonas deben ser incluidos. Alternativamente, puede ser posible aislar poli-nucleosomal fracciones de extractos de cerebro humano, con menores tiempos de incubación de la digestión nucleasa micrococal junto con las etapas de purificación adicionales (incl. ultracentrifugación). Finalmente, un estudio reciente sobre el genoma factor de transcripción vinculante en el cerebro postmortem simplemente cortados de la cromatina a través de ultrasonidos 4. En particular, la preparación de la cromatina de la fijación antes de la digestión enzimática o ultrasonidos basado puede no ser ideal desde el punto de vista de los estudios post mortem, porque la degradación y / o reconfiguración artificial de estructuras de orden superior cromatina después de la muerte se confunde potencial difícil de controlar para. Por lo tanto, ensayos de chip en el cerebro post mortem es probable que sean útiles para un número limitado de moléculas, incluyendo histonas y otras proteínas nucleosomal muy bien fijadas a la ADN genómico. A pesar de esta advertencia en cuenta, los enfoques descritos en esta presentación es probable que proporcionar nuevos conocimientos sobre la cromatina asociada mecanismos que rigen las funciones neuronales y gliales en el cerebro humano normal y enfermo.

Hemos utilizado esta técnica con éxito sobre todo para la medición de metilación de las histonas y las ocupaciones de histonas en promotores específicos utilizando gen por gen qPCR 1, 5, 6. Como se mencionó anteriormente el cerebro postmortem humano parece ser susceptible al estudio de la mono-nucleosomal preparados, porque el ADN se mantiene en gran parte unido a las histonas centrales. Por lo general, cuando se comienza con 75 mg de niño o de un adulto la corteza cerebral (materia gris) se puede esperar con el protocolo presentado anteriormente un rendimiento de 20 a 30 ng / l en un volumen total de 50 l para la entrada y 10-15 ng / l en un volumen total de 50 l para el chip, por lo menos cuando la modificación específica de anticuerpos anti-histonas se utilizan. El chip llamado a la relación de entrada es la unidad de medida. La especificidad de la reacción se sigue por la fusión de análisis de la curva, la electroforesis en gel y secuenciación. Además, los controles negativos (i) que carecen de los anticuerpos específicos, o (ii) que contiene (no específicos) inmunoglobulina debe ser procesado por qPCR en paralelo con el chip y las muestras de entrada y no debe dar lugar a productos específicos. Tenga en cuenta que cuando el esperma de salmón se usa como un agente de bloqueo, las muestras de control puede resultar en una prueba cuando se ejecuta en un gel.

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Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de Salud Mental (5R01MH071476).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-HCl EMD Millipore 9310
Magnesium Chloride Hexahydrate OmniPur, EMD Millipore 5980
Calcium Chloride Fisher Scientific C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 OmniPur, EMD Millipore 4055
Sodium Chloride Mallinckrodt Baker Inc. 7581-06
SDS Solution 10% (w/v) Bio-Rad 161-0416
Triton X-100 Fluka 93426
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I-3021
Sodium Deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-25G
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650-100G
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous) Sigma-Aldrich S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus Sigma-Aldrich N3755-200UN
Benzamidine Fluka 12072
Phenylmethanesulfonylfluoride Sigma-Aldrich P7626-1G
3M DTT Fluka 43815
Protein G Agarose, Fast Flow Upstate, Millipore 16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit Stratagene, Agilent Technologies 201190
Proteinase K from Engyodontium album Sigma-Aldrich P2308
Phenol:Chloroform 1:1 OmniPur, EMD Millipore 6810
Glycogen, From Mussels Sigma-Aldrich G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof) Pharmco-AAPER 111000200

Solutions:

  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.

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References

  1. Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.
  2. Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters. J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.
  3. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, 76-82 Forthcoming.
  4. Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain. Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.
  5. Huang, H. uang, Akbarian, S. GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia. PLoS ONE. 2, Forthcoming.
  6. Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain. J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.

Comments

3 Comments

  1. Dear Dr, I am selvakumar, Research scholar, Dept of Endocrinology,University of madras, chennai- India. I Need aclarification, whether is is possible in the rat brain. Send some assay, protocol in brain regions, thanking you, with regards selvakumar 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 21, 2008 - 9:25 AM
  2. Hi, What company did you purchase the tissue homogenizer from for douncing the brain tissue? Thanks, Pritika

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2009 - 10:19 PM
  3. Hi, Pritika, The tissue homogenizer is a Wheaton Science Product. We purchased from Fisher Scientific. Thank you. Yan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 7, 2009 - 9:29 AM

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