Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

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Biology

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Summary

Wir haben die Plazenta als wichtiger blutbildenden Organ während der Entwicklung identifiziert. Wir fanden, dass hämatopoetische Stammzellen (HSZ) sind beide generiert und erweitert in der Plazenta in einzigartige Mikroumgebung Nischen. Hier beschreiben wir experimentelle Techniken zur Isolierung und Visualisierung von HSZ in der Maus Plazenta erforderlich.

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Gekas, C., E. Rhodes, K., K. A. Mikkola, H. Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta. J. Vis. Exp. (16), e742, doi:10.3791/742 (2008).

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Abstract

Hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) haben die Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und generieren alle Zelltypen des Blutes Linien über die gesamte Lebensdauer eines Individuums. Alle HSCs entstehen während der embryonalen Entwicklung, nach denen ihre Pool-Größe durch sich selbst erneuernden Zellteilungen wird beibehalten. Die Ermittlung der anatomischen Ursprung der HSC und die kritische Entwicklungsschritte regulieren den Prozess der HSC Entwicklung wurde kompliziert, wie viele anatomische Sites während der fetalen Hämatopoese beteiligt. Kürzlich haben wir festgestellt, die Plazenta als wichtiger blutbildenden Organ, in dem HSC generiert und erweitert in einmaliger Mikroumgebung Nischen (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Folglich ist die Plazenta eine wichtige Quelle für Blutstammzellen bei ihrer Entstehung und erste Expansion.

In diesem Artikel zeigen wir Dissektion Techniken zur Isolierung von murinen Plazenta von E10.5 und E12.5 Embryonen, entsprechend der Entwicklungsstadien der Einleitung von HSK und die Spitze in der Größe der HSC-Pool in der Plazenta, bzw.. Darüber hinaus präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die enzymatische und mechanische Dissoziation von Plazentagewebe in den Single-Zell-Suspension für den Einsatz in der Durchflusszytometrie oder funktionellen Assays. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung von Kollagenase für Einzel-Zell-Suspension der Plazenta auskömmlichen Renditen von HSK gibt. Ein wichtiger Einflussfaktor HSC Ertrag aus der Plazenta ist der Grad der mechanischen Dissoziation vor, und die Dauer der, enzymatische Behandlung.

Wir bieten auch ein Protokoll für die Herstellung von festen gefrorenen Plazentagewebe Abschnitte für die Visualisierung der Entwicklung von Blutstammzellen durch Immunhistochemie in ihrer genauen zellulären Nischen. Als hämatopoetischen spezifische Antigene nicht während der Herstellung der in Paraffin eingebetteten Abschnitte erhalten sind, verwenden wir routinemäßig fixiert Gefrierschnitten für die Lokalisierung der Plazenta HSCs und Vorläuferzellen.

Protocol

1. Embryo und Plazenta Entfernung Dissektion

  1. Um zu beginnen, müssen Embryonen zunächst von schwangeren Muttertiere isoliert werden.
  2. Die Tiere sind gemäß den vereinbarten Verfahren eingeschläfert - in unserem Fall werden wir eine tödliche Dosis des Anästhetikums Isofluran verwenden
  3. Zuerst sprühen den Bauch mit Ethanol und machen einen kleinen Schnitt mit einer Schere.
  4. Losreißen die Haut mit beiden Händen auf den Bauch aufzudecken und aufgeschnitten das Bauchfell.
  5. Mit Pinzette, nehmen Sie den Uterushörner und sammeln sie mit einer Schere an jedem distalen Ende. Legen Sie die Uterushörner in eine Petrischale mit PBS und auf Eis gefüllt. Denken Sie auch daran, mehrmals mit PBS waschen, bevor die Isolierung des Plazenta. Wir können nun isolieren die Plazenta.
  6. Mit zwei Zangen, beginnen vorsichtig Abziehen der Endometrium-Gewebe rund um den Embryo conceptuses. Man sollte darauf achten, nicht zu durchstechen oder anderweitig zufügen strukturelle Schäden an den Embryonen, da diese nachfolgenden Schritte Dissektion erschweren wird.
  7. Legen Sie die isoliert conceptuses in eine neue Petrischale mit PBS auf Eis und weiter, bis alle conceptuses aus dem Endometrium befreit worden wären.
  8. Transfer ein conceptus, um eine neue Petrischale mit PBS unter dem Mikroskop und mit zwei Pinzetten schälen decidua weg von der Plazenta gelegt. Entfernen Sie so viel von der Dezidua wie möglich Deciduazellen wird mit Einzel-Zell-Suspension und Durchflusszytometrie stören. Eine glatte kontinuierliche Peeling Bewegung wird empfohlen, die besten Ergebnisse zu erzielen.
  9. Cut der Dottersack weg von der Plazenta an der Kreuzung zwischen den beiden Organen und ziehen Sie den Dottersack und Dotter-Schiffe weg von der Plazenta. Es sollte darauf geachtet werden, dass der Chorionplatte der Plazenta stören, vor allem mit frühen Embryonen werden.
  10. Vorsichtig hält die Chorionplatte der Plazenta mit einer Pinzette und die Nabelschnur mit einem anderen, ziehen die Nabelschnur und die angeschlossenen Embryo weg von der Plazenta.
  11. Entfernen Sie überschüssiges Riesenzelle Gewebe an den Rändern der Plazenta, um Zellen verklumpen während der Vorbereitung von Einzel-Zell-Suspension zu minimieren.
  12. Sammeln Sie die Plazenta in einen geeigneten Behälter, wie ein 15-ml-Falcon-Röhrchen mit PBS +5% FCS und auf Eis. Tun Sie dies für alle Plazenten seziert.
  13. An dieser Stelle können Sie entweder mit der Vorbereitung der Ein-Zell-Suspension für die Durchflusszytometrie, funktionelle Assays, wie in vitro-Kultur oder Transplantation gehen, oder bereiten ganze Plazenta für die Gewebe-Fixierung und festen gefrorenen Block Einbettung für eventuelle Immunhistochemie.

2. Erstellung von Einzel-Zellsuspension von Placentagewebe

  1. Wir werden nun zeigen, wie eine einzige Zellsuspension aus Plazenta für FACS-Analyse erstellt werden soll.
  2. Zur Vorbereitung einer Zellsuspension aus Plazenta, mechanische und enzymatische Dissoziation ist nicht erforderlich. Bereiten Sie zunächst die 0,1% Collagenase-Lösung in PBS mit 10% FCS und 1% Penicillin / Streptomycin-Lösung.
  3. Fügen Sie ein geeignetes Volumen von Kollagenase Lösung der Plazenta, je nachdem, wie viele Sie haben. Ein Volumen, das zweimal die Plazenta Volumen und zwischen 2-5ml wird empfohlen.
  4. Verwenden Sie eine 16-G-Nadel auf einer 5-ml-Spritze mechanisch stören das Gewebe durch Passagieren die Collagenase-Lösung und der Plazenta durch die Nadel 3 mal angebracht. Wiederholen Sie mit einem 18-G-Nadel.
  5. Legen Sie die Probe in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für 45 Minuten.
  6. Nach der 45 minütigen Inkubation in Kollagenase, Passage der Zell-Lösung durch eine 20-G-Nadel, und Inkubation für weitere 45 Minuten, in 37 ° C.
  7. Nach dem 1,5 Std. insgesamt Inkubation in Kollagenase, Passage der Zell-Lösung durch 22-G und 25-G Nadeln 3-mal mit jeder Nadel.
  8. Filtern Sie die Probe durch eine 50-um-Filter angebracht, um eine neue 15-ml-Falcon-Röhrchen mit PBS +5% FCS und Zentrifuge Waschen bei 4 ° C für 5 Minuten bei 300 × g.
  9. An dieser Stelle haben wir eine einzelne Zellsuspension für FACS-Analyse oder funktionellen Assays.


3. Tissue Fixation für Gefrierschnitte

  1. Direkt nach dem Freischalten der Plazenta von jedem Embryo, sind sie in kaltem 1X PBS gelegt. Normalerweise wird eine 96-Well-Platte funktioniert am besten für junge Plazenten (E8.5-11.5), sondern mit älteren Plazenten, E12.5 und älter, eine 24-Well-Platte ist zwar recht praktisch.
  2. Jede Plazenta ist in eine neue, gut gefüllt mit frisch aufgetauten 4% paraformaldahyde oder PFA übertragen. Für die E12.5 Plazenten, wird das Gewebe um einen neuen Brunnen von Hand bewegt, aber für die E10.5 können Sie die PBS vorsichtig mit einer Pipette und fügen Sie die PFA. Es ist wichtig, dass die Plazenta vollständig für 2-4 Stunden bei 4 ° C getaucht, je nach Alter und Größe des Gewebes.
  3. Übertragen Sie die Gewebe in 30% Saccharose, oder wenn das Gewebe sehr klein und zerbrechlich sind, saugen Sie den PFA und fügen Sie die Saccharose direkt. In diesem Stadium wird die Plazenta in Lösung zu schweben. Lassen Sie das Gewebe bleiben über Nacht bei 4 ° C.
  4. Nach der Übernachtung Schritt in 30% Saccharose, sollte das Gewebe schließlich auf den Grund des Brunnens, bezeichnend für richtige Kryokonservierung sinken. Entfernen Sie die Hälfte der Saccharose-Lösung und setzen Sie die Lautstärke mit OCT und Ort des Gewebes wieder in 4 ° C für 1-2 Stunden. Dies erleichtert Oktober Penetration.
  5. Transfer des Gewebes auf 100% OCT für 1 Stunde, nach dem sie eingebettet werden können.

4. Die Einbettung der fixierten Gewebe

  1. Label Kunststoffformen mit entsprechenden Gewebe-Identifikation (Karte B. Schimmel).
  2. Ziehen Sie das Gewebe von der OCT-Lösung und schneiden die Plazenta in der Hälfte durch die Ausrichtung der scheibenförmigen Plazenta mit der Nabelschnur nach unten und sorgfältig Schneiden mit einer Rasierklinge achten Sie darauf, die Klinge hin und her bewegen, bevor die Freigabe Druck, um sicherzustellen, ein noch geschnitten. Die Plazenta ist in zwei Hälften geschnitten, um die besten prientation erreichen später visualisieren die Plazenta HSK.
  3. Legen Sie eine Plazenta Hälfte bei den Boden der Form mit der Schnittkante in Kontakt mit der Bodenfläche der Form. Wiederholen Sie mit einem neuen Werkzeug für die andere Hälfte. Für E10.5 Plazenten, können beide Hälften in der gleichen Form mit der gleichen Technik angebracht werden.
  4. Beim Eingießen ÜLG in der Form, kann es schwierig sein, die Plazenta in die richtige Orientierung zu behalten. Sichern Sie die Plazenta statt, indem das Gewebe zur Hälfte mit einer Pinzette. Langsam pour Oktober-Lösung in der Form und vermeiden jegliche Blasen. Für E10.5 Plazenten, halten einem Gewebetyp Hälfte von Pinzette und Ruhe der anderen Gewebe Hälfte gegen die Außenseite der Pinzette. Langsam pour Oktober Lösung für E12.5 Plazenten beschrieben.
  5. Sobald die Form mit OCT gefüllt ist, schnell Platz die Form auf Trockeneis, wird der OCT wiederum weißen Blitz Einfrieren des Gewebes
  6. Legen Sie die Form in einen kleinen Plastikbeutel mit Drierite und sofort in den -80 ° C Gefrierschrank lagern.

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Discussion

Die experimentellen Verfahren in diesem Protokoll beschrieben wird für die Isolierung und die Visualisierung von Plazentagewebe und hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen zu ermöglichen. Für einen umfassenden Überblick über erwartete zellulären Ertrag und Anzahl der HSZ in Plazenta und anderen fetalen blutbildenden Organe während der fetalen Entwicklung verweisen wir auf Gekas, et al. 2005. Für die Lokalisierung der Entwicklung von Blutstammzellen und anderen hämatopoetischen Zellen in der Plazenta verweisen wir auf Rhodos, et al. 2008.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. The placenta is a niche for hematopoietic stem cells. Dev Cell. 8, 365-375 (2005).
  2. Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation. Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).

Comments

3 Comments

  1. Dear Melanie This is Vinod from India, i am doing some experiments with bone marrow derivd mouse dendritic cells. As you have shown in the video breaking the big clumps of bone marrow using pipette, this causes a lot of activation to the denderitic cells prior to the maturation. can u suggest me how to minimize this activation. regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 28, 2008 - 6:45 AM
  2. can i know the name of all marker used in the analysis of the embed fixed- frozen section of placenta? thanks Vincenzo Manfellotto from  Federico II University of study in NAples, Italy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 13, 2009 - 8:39 AM
  3. Hi, Yes we used cytokeratin to mark the trophoblast, cd31 to mark the endothelium and cd41 for the hematopoietic cells. Katrin

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 3:26 PM

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