न्युट्रोफिल अलगाव प्रोटोकॉल

Biology

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Summary

Neutrophils सूजन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साइट पर आने के लिए सबसे पहले कोशिकाओं के बीच हैं, और उनके कार्यों और तंत्र इन विट्रो में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है. हम एक मानक घनत्व ढाल जुदाई विधि पूरे रक्त का उपयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जुदाई मीडिया से मानव neutrophils अलग प्रदर्शित करता है.

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Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).

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Abstract

न्युट्रोफिल polymorphonuclear granulocytes (PMN) मनुष्यों में और सूजन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साइट पर आने के लिए सबसे पहले कोशिकाओं के बीच सबसे प्रचुर मात्रा में leukocytes में हैं. सूजन में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, हरकत, cytokine उत्पादन, phagocytosis, और ट्यूमर कोशिका का मुकाबला जैसे न्युट्रोफिल कार्य बड़े पैमाने पर अध्ययन कर रहे हैं. Neutrophils के विशिष्ट कार्यों विशेषताएँ के लिए, उन्हें अन्य रक्त कोशिकाओं से अलग की एक साफ, तेज, और विश्वसनीय विधि के लिए इन विट्रो अध्ययन में वांछनीय है, खासकर के बाद से neutrophils अल्पकालिक हैं और संग्रह के 2-4 घंटे के भीतर प्रयोग किया जाना चाहिए. यहाँ, हम एक मानक घनत्व ढाल जुदाई विधि पूरे रक्त का उपयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जुदाई मीडिया है कि सोडियम metrizoate और Dextran 500 का एक मिश्रण है से मानव neutrophils अलग प्रदर्शित करता है. प्रक्रिया layering घनत्व ढाल मध्यम, centrifugation न्युट्रोफिल परत की जुदाई, और अवशिष्ट एरिथ्रोसाइट्स के lysis पर पूरे रक्त के होते हैं. कोशिकाओं तो धो रहे हैं, गिना, और इच्छित एकाग्रता के लिए बफर में resuspended. जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, इस विधि के लिए>> 95% व्यवहार्यता के साथ 95% neutrophils के नमूने उपज के लिए दिखाया गया है.

Protocol

न्युट्रोफिल अलगाव प्रोटोकॉल

  1. कमरे के तापमान पर सभी अभिकर्मकों लाओ.
  2. न्युट्रोफिल अपकेंद्रित्र ट्यूब में अलगाव मीडिया के 5.0 मिलीलीटर लीजिए. ध्यान जुदाई मीडिया से अधिक रक्त की परत 5.0 मिलीलीटर. इस कदम का प्रदर्शन धीरे धीरे और ध्यान से, और विंदुक मीडिया की सतह के करीब रक्त और मीडिया मिश्रण से बचने के टिप के साथ.
  3. 20-25 में 35 मिनट के लिए 500 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस प्लाज्मा, monocytes, अलगाव मीडिया, neutrophils, और अधिक अलगाव मीडिया, और लाल रक्त कोशिका गोली (चित्रा 1): रक्त 6 अलग बैंड में अलग होना चाहिए. यदि इन बैंड स्पष्ट नहीं कर रहे हैं, जुदाई प्रक्रिया को स्वच्छ और नहीं दोहराया जा आवश्यकता होगी.
  4. ध्यान से शीर्ष तीन (प्लाज्मा, monocytes, और अलगाव मीडिया) एक विंदुक का उपयोग कर परतों को हटा दें. इन परतों को फेंक.
  5. ध्यान neutrophils और neutrophils नीचे अलगाव मीडिया के सभी परत विंदुक. एक साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब में समाधान रखें.
  6. 2 Ca + मिलीग्राम / 2 + के बिना HBSS के साथ 10 मिलीलीटर न्युट्रोफिल समाधान पतला. ट्यूब कुछ समय उलटें निलंबित करने के लिए कोशिकाओं.
  7. 10 मिनट के लिए 350 आरसीएफ पर न्युट्रोफिल समाधान अपकेंद्रित्र. एक लाल गोली ट्यूब के नीचे मौजूद हो सकता है, neutrophils और अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) से युक्त होना चाहिए. एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला ध्यान से इतना है कि गोली परेशान नहीं है निकालें.
  8. अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाओं lyse, ट्यूब को 2 मिलीलीटर लाल सेल lysis बफर जोड़ने. गोली, 3-4 की सेटिंग में शीशी भंवर resuspend. ऊपर 4 भंवर सेटिंग बढ़ाने से बचें, के बाद से इस neutrophils सक्रिय करने के लिए कारण हो सकता है. यह कई सेकंड के लिए भंवर के लिए आवश्यक हो सकता है, या हो सकता गोली भंग भंवर "पल्स".
  9. 5 मिनट के लिए 250 आरसीएफ पर ट्यूब अपकेंद्रित्र. विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें. Lysing प्रक्रिया दोहराएँ यदि आवश्यक हो.
  10. 2 Ca + मिलीग्राम / 2 के बिना 500 μl HBSS प्रत्येक ट्यूब + जोड़ें . फिर, 3-4 की सेटिंग में गोली resuspend भंवर. 2 Ca + मिलीग्राम / 2 + के बिना HBSS के साथ 10 मिलीलीटर के लिए पतला.
  11. 5 मिनट के लिए 250 आरसीएफ पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और त्यागने.
  12. 250 μl HBSS / HSA समाधान (2% HSA) में गोली Resuspend. कोशिकाओं तो गिना जा सकता है इच्छित एकाग्रता के लिए समायोजित है.

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Discussion

घनत्व ढाल जुदाई विधि सोडियम metrizoate और Dextran 500 का एक मिश्रण का उपयोग कर पूरे रक्त से मानव neutrophils अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस विधि mononuclear Boyum (1968) द्वारा ल्युकोसैट जुदाई तरीका है जो न्युट्रोफिल जुदाई के लिए Ferrante और पेटी (1980) के द्वारा संशोधित किया गया था पर आधारित है.

एक दाता से संग्रह करने के बाद, पूरे रक्त EDTA, साइट्रेट, या हेपरिन के साथ anticoagulated हो सकता है. चूंकि वे अल्पकालिक हैं, neutrophils संग्रह के 2-4 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए. प्रक्रिया layering घनत्व ढाल मध्यम, centrifugation न्युट्रोफिल परत की जुदाई, और अवशिष्ट एरिथ्रोसाइट्स के lysis पर पूरे रक्त के होते हैं. कोशिकाओं तो धो रहे हैं, गिना, और इच्छित एकाग्रता के लिए resuspended.

यदि पहली centrifugation कदम के बाद छह बैंड अलग नहीं कर रहे हैं, जुदाई प्रक्रिया को स्वच्छ और नहीं दोहराया जा आवश्यकता होगी. साफ जुदाई के लिए, यकीन है कि अलगाव मीडिया की अवधि समाप्त हो या दूषित नहीं है. पृथक्करण भी असफल हो सकता है अगर रक्त दाता रक्त संग्रह करने से पहले 72 घंटे में शराब या दवाओं का सेवन किया है हो सकता है.

जुदाई प्रक्रिया के दौरान न्युट्रोफिल सक्रियण को रोकने के लिए, यह सबसे अच्छा है सीए 2 बिना HBSS उपयोग + / Mg2 + के बाद से आयनों प्रधानमंत्री कोशिकाओं को दिखाया गया है. छर्रों का Resuspension भी धीरे धीरे प्रदर्शन किया जाना चाहिए, और भंवर सेटिंग्स में कम इतना है कि मध्य दूरी की कोशिकाओं नहीं बन कर सक्रिय रखा जाना चाहिए.

जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, इस विधि के लिए>> 95% व्यवहार्यता के साथ 95% neutrophils के नमूने उपज के लिए दिखाया गया है. पवित्रता और व्यवहार्यता न्युट्रोफिल विशिष्ट मार्कर CD66b और trypan नीले डाई अपवर्जन के साथ कोशिकाओं लेबलिंग के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है.

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Acknowledgments

एनआईएच R01 HL56621 से अनुदान.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Poly(R) Reagent Cedarlane Labs PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride Reagent Invitrogen
Human Serum Albumin Reagent ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer Reagent Roche Group
Centrifuge Tool
Vortexer Tool
Pasteur Pipettes and bulb Tool
PolymorphprepTM Reagent Axis-Shield Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter Other EMD Millipore SLGV033RS Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride Reagent Invitrogen

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References

  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).

Comments

21 Comments

  1. what is the rational for using whole blood instead of purified white blood cells or enriched neutrophils for NBT test???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 28, 2008 - 12:37 PM
  2. Why must HSA and not BSA be used? Do you have references for the effect of ETOH and drugs on separation success, and mechanism of action?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 29, 2008 - 11:21 AM
  3. BSA can activate neutrophils. Brian Siano, on behalf of Hana Oh and Scott Diamond

    Reply
    Posted by: Brian S.
    October 29, 2008 - 11:43 AM
  4. How many HBSS and how many HSA need for HBSS/HSA solution preparation?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 21, 2009 - 2:50 PM
  5. hi, why do you use HSA? or what is the action of HSA in buffer?  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 10, 2009 - 3:14 AM
  6. so many things contradict in the movie vs your text

    Reply
    Posted by: Laura K.
    December 4, 2009 - 4:00 PM
  7. From JoVE editor: video and text are complementary parts of each video-article. They are not necessarily 100% the same. There are things that are better described in video than in text, and vice versa. I think in this case the video part is very comprehensive and provides a very clear demonstration on how to do the experiment.

    Reply
    Posted by: Moshe P.
    December 7, 2009 - 3:22 PM
  8. Are there any other reasons why one will not get 6 bands of separation using Polymorphprep? My separation is still not perfect. Repeatign causes the monocyte layer to lower towards the neutrophils. Any suggestions? Donor blood is not affected as mentioned in your video.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2010 - 11:28 PM
  9. Any suggestions of modify this protocol so that it will work with NHP blood?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2011 - 6:36 PM
  10. Why is ²% HSA added in the last step? What is the advantage of doing that? And what happens is I dont add it?

    Reply
    Posted by: Alex B.
    July 6, 2011 - 3:59 AM
  11. DŒs HBBS for HBBS/HSA preparation contain Ca AND Mg or only Ca?

    Reply
    Posted by: Marija P.
    November 3, 2011 - 3:20 PM
  12. I believe the question above refers to the last step of resuspension of neutrophils. At this point you could use various types of buffer solutions that suite your specific experimental goals. If trying to create a suspension of neutrophils in a physiological saline buffer, both Ca and Mg can be added.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 3:27 PM
  13. I notice that the HBSS contains no phenol red in your neutrophil isolation method. I have noticed that phenol red is avoided (both during isolation and during experiments) in a number of papers implementing neutrophil isolation techniques. Any idea what phenol red dŒs to neutrophils? I have used a variation on the isolation technique (generously shared by Drs. Oh, Siano and Diamond) and ended by suspending my isolated neutrophils in RPMI with phenol red. Although phenol red might not be the (only) culprit, I am not seeing any neutrophil killing activity (ADCC assay).
    I plan to attempt the method provided in this video later this week. Any ideas about phenol red?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 9:58 AM
  14. We avoid pH indicator dyes because they often cause autofluorescence and lead to high background in fluorescent assays. We don't have any direct measurements of fluorescent dyes on neutrophil function.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 10:10 AM
  15. I have seen that during neutrophil isolation from my blood there is no layer of neutrophils while there is a thick band of ruptured RBC at that position,every time.Can anyone suggest me,what could be the reason for that?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2012 - 4:25 AM
  16. I'm getting the same result every time. Did you ever find out what's causing a thick band of RBC at the position of neutrophils bands?

    Reply
    Posted by: Zahra M.
    February 17, 2014 - 12:23 PM
  17. I have been in face of the same problem that part of RBC can not sediment to the bottom band. This almost happpens when centrifuging at 500RCF but hardly happen at 450 RCF. So I guess 500 RCF is inappropriate.

    Reply
    Posted by: Xu L.
    May 25, 2017 - 3:50 AM
  18. Is this protocol applicable to Dog and Rat Neutrophil isolation? If so, do I still use HSA?

    Reply
    Posted by: Vishnu U.
    June 27, 2012 - 3:04 PM
  19. I have a similar question. I am interested in using this protocol to isolate neutrophils from mouse whole blood. Did you ever find out if this protocol works for rat neutrophil isolation?

    Reply
    Posted by: Hanna M.
    January 29, 2014 - 1:59 PM
  20. Hi. It is said in the article that the neutrophil yield would be 2x10^6 per ml. Does that mean 2x10^6 per ml of whole blood used? So using 5 ml of blood (as used in the article) would yield 10 million neutrophils?
    I got an extremely low count for my neutrophils. about 2 million from 5ml blood. Can you please help me troubleshoot?
    Also, why did you mention 10-15ml blood (yielding x10^8 cells) in the beginning? Is it that you carry out the isolation from 10-15 ml blood in 2 or 3 parts of 5 ml each? Please help.
    Thanks.

    Reply
    Posted by: Sumana B.
    September 25, 2014 - 3:17 PM
  21. I a following this protocol, but running into clumping of the cells. Is there any way to prevent this from happening?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2017 - 9:52 PM

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