호중구 격리 프로토콜

Biology

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Summary

Neutrophils은 염증성 면역 반응의 사이트에 도착을 가장 먼저 세포 사이에하며, 그들의 기능과 메커니즘은 체외에서 광범위하게 연구되고있다. 우리는 상용 분리 미디어를 사용 전체 혈액에서 인간 neutrophils을 분리하기위한 기준 밀도 기울기 분리 방법을 보여줍니다.

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Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).

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Abstract

호중구 granulocytes polymorphonuclear (PMN)는 인간과 염증성 면역 반응의 사이트에 도착을 가장 먼저 세포 중 가장 풍부한 leukocytes 있습니다. 염증에서 중요한 역할로 인해, 이러한 운동, 시토킨 생산, phagocytosis, 그리고 종양 세포 전투로 호중구 기능이 광범위하게 연구하고 있습니다. neutrophils 짧은 - 살았하고 수집 2-4시간 이내에 사용해야합니다 특히 이후 neutrophils의 특정 기능을 특성화, 다른 혈액 세포에서 그들을 분리 깨끗하고, 빠르고, 안정 방법은, 체외 연구에서 위해 바람직합니다. 여기서 우리는 나트륨 metrizoate 및 Dextran 500의 혼합물이다 상용 분리 미디어를 사용 전체 혈액에서 인간 neutrophils을 분리하기위한 기준 밀도 기울기 분리 방법을 보여줍니다. 절차는 밀도 기울기 매체, 원심 분리, 호중구 계층의 분리, 그리고 잔류 적혈구의 용해를 통해 겹겹이 전체 혈액으로 구성되어 있습니다. 전지는 다음 씻어 계산하고, 원하는 농도 버퍼에 resuspended 있습니다. 제대로 수행되면,이 방법은> 95 % 생존과> 95 % neutrophils의 샘플을 항복을 보여줘왔다.

Protocol

호중구 격리 프로토콜

  1. 상온 모든 시약을 가져와.
  2. 원심 분리기 튜브의 호중구 격리 미디어 5.0 ML를 수집합니다. 분리 미디어를 통해 혈액 조심스럽게 층 5.0 ML. 천천히 그리고 신중하게, 그리고 혈액과 미디어를 혼합 피하기 위해 미디어의 표면에 가까운 피펫 팁이 단계를 수행합니다.
  3. 20-25에서 35 분 500 RCF에서 원심 분리기 ° C. 플라즈마, monocytes, 절연 매체, neutrophils, 더 절연 매체, 그리고 적혈구 세포 펠릿 (그림 1) 피는 6 별개의 밴드 밖으로 분리한다. 이 밴드가 명확하지 않은 경우, 분리 과정이 깨끗하지 못한 반복해야합니다.
  4. 조심스럽게 피펫을 사용하여 세 가지 레이어 (플라즈마, monocytes, 그리고 절연 매체)를 제거하십시오. 이러한 레이어의 배출.
  5. 조심스럽게 neutrophils과 neutrophils 아래 격리 미디어의 모든 레이어를 피펫. 깨끗한 원심 분리기 튜브에 솔루션을 놓으십시오.
  6. 칼슘 2 + / MG 2 + 않고 HBSS 10 ML에 호중구 솔루션을 희석. 세포를 일시 중 지할 수있는 튜브를 몇 번 반전.
  7. 10 분 350 RCF에서 호중구 솔루션을 원심 분리기. 빨간 펠렛은 neutrophils 및 잔여 적혈구 (RBCs)를 포함, 튜브의 하단에 제시해야합니다. 신중하게 그래서 펠렛가 방해되지 않았음을 피펫으로 뜨는을 제거합니다.
  8. 잔류 RBCs를 lyse하려면, 튜브 2 ML 레드 세포 용해 완충액을 추가합니다. 펠렛, 소용돌이 3-4의 설정에 병을 resuspend한다. 이것은 neutrophils가 활성화가 발생할 수 있으므로, 4 위의 소용돌이 설정을 증가하지 마십시오. 그것은 몇 초 동안 와동해야 할 수도 있습니다, 또는 펠렛을 분해하는 소용돌이를 "펄스"로.
  9. 5 분 250 RCF에서 튜브를 원심 분리기. 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 필요한 경우 lysing 과정을 반복합니다.
  10. 칼슘 2 + / MG이없이 500 μl HBSS를 추가 + 각 튜브 수 있습니다. 다시 3-4의 설정에서 펠렛을 resuspend하는 소용돌이. 칼슘 2 + / MG 2 + 않고 HBSS 10 ML로 희석.
  11. 5 분 250 RCF에서 튜브를 원심 분리기. 뜨는을 대기음 및 폐기.
  12. 250 μl HBSS / HSA 솔루션 (2 % HSA)의 펠렛을 Resuspend. 전지는 다음 계산하고 원하는 농도로 조정할 수 있습니다.

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Discussion

밀도 기울기 분리 방법은 나트륨 metrizoate와 Dextran 500의 혼합물을 사용하여 전체 혈액에서 인간 neutrophils을 분리하는 데 사용됩니다. 이 방법은 Ferrante과 통 (1980)에 의해 호중구 분리으로 바뀌었습니다 Boyum (1968)에 의해 mononuclear 백혈구 분리 방식에 따라 달라집니다.

기증자로부터 수집 후, 전체 혈액은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 구연 산염, 또는 헤파린과 anticoagulated 수 있습니다. 그들은 짧은 - 살았되므로, neutrophils는 컬렉션의 2~4시간 이내에 사용해야합니다. 절차는 밀도 기울기 매체, 원심 분리, 호중구 계층의 분리, 그리고 잔류 적혈구의 용해를 통해 겹겹이 전체 혈액으로 구성되어 있습니다. 전지는 다음 씻어 계산하고, 원하는 농도 resuspended 있습니다.

여섯 밴드가 처음 원심 분리 단계 후에 별개하지 않는 경우, 분리 과정이 깨끗하지 못한 반복해야합니다. 깨끗한 분리, 절연 미디어가 만료되었거나 오염되지 않았는지 확인합니다. 혈액 기증자 혈액 수집하기 전에 72 시간 이내에 알코올이나 약물을 섭취있다면 분리도 실패할 수 있습니다.

분리 절차를 수행하는 동안 호중구 활성화를 방지하기 위해, 그것이 Ca2없이 HBSS를 사용하는 것이 가장 좋습니다 + / Mg2 + 이온이 주요 세포로 표시되었습니다 때문이다. 알약의 Resuspension도 천천히 수행되어야하고, 소용돌이 설정은 낮은 중순 범위 있도록 세포가 될 수없는거야 활성화에 보관해야합니다.

제대로 수행되면,이 방법은> 95 % 생존과> 95 % neutrophils의 샘플을 항복을 보여줘왔다. 순도 및 생존 능력은 호중구 특정 마커 CD66b와 trypan 블루 염색 제외있는 세포를 라벨에 의해 평가하실 수 있습니다.

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Acknowledgments

NIH R01 HL56621에서 자금.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Poly(R) Reagent Cedarlane Labs PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride Reagent Invitrogen
Human Serum Albumin Reagent ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer Reagent Roche Group
Centrifuge Tool
Vortexer Tool
Pasteur Pipettes and bulb Tool
PolymorphprepTM Reagent Axis-Shield Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter Other EMD Millipore SLGV033RS Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride Reagent Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).

Comments

21 Comments

  1. what is the rational for using whole blood instead of purified white blood cells or enriched neutrophils for NBT test???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 28, 2008 - 12:37 PM
  2. Why must HSA and not BSA be used? Do you have references for the effect of ETOH and drugs on separation success, and mechanism of action?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 29, 2008 - 11:21 AM
  3. BSA can activate neutrophils. Brian Siano, on behalf of Hana Oh and Scott Diamond

    Reply
    Posted by: Brian S.
    October 29, 2008 - 11:43 AM
  4. How many HBSS and how many HSA need for HBSS/HSA solution preparation?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 21, 2009 - 2:50 PM
  5. hi, why do you use HSA? or what is the action of HSA in buffer?  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 10, 2009 - 3:14 AM
  6. so many things contradict in the movie vs your text

    Reply
    Posted by: Laura K.
    December 4, 2009 - 4:00 PM
  7. From JoVE editor: video and text are complementary parts of each video-article. They are not necessarily 100% the same. There are things that are better described in video than in text, and vice versa. I think in this case the video part is very comprehensive and provides a very clear demonstration on how to do the experiment.

    Reply
    Posted by: Moshe P.
    December 7, 2009 - 3:22 PM
  8. Are there any other reasons why one will not get 6 bands of separation using Polymorphprep? My separation is still not perfect. Repeatign causes the monocyte layer to lower towards the neutrophils. Any suggestions? Donor blood is not affected as mentioned in your video.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2010 - 11:28 PM
  9. Any suggestions of modify this protocol so that it will work with NHP blood?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2011 - 6:36 PM
  10. Why is ²% HSA added in the last step? What is the advantage of doing that? And what happens is I dont add it?

    Reply
    Posted by: Alex B.
    July 6, 2011 - 3:59 AM
  11. DŒs HBBS for HBBS/HSA preparation contain Ca AND Mg or only Ca?

    Reply
    Posted by: Marija P.
    November 3, 2011 - 3:20 PM
  12. I believe the question above refers to the last step of resuspension of neutrophils. At this point you could use various types of buffer solutions that suite your specific experimental goals. If trying to create a suspension of neutrophils in a physiological saline buffer, both Ca and Mg can be added.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 3:27 PM
  13. I notice that the HBSS contains no phenol red in your neutrophil isolation method. I have noticed that phenol red is avoided (both during isolation and during experiments) in a number of papers implementing neutrophil isolation techniques. Any idea what phenol red dŒs to neutrophils? I have used a variation on the isolation technique (generously shared by Drs. Oh, Siano and Diamond) and ended by suspending my isolated neutrophils in RPMI with phenol red. Although phenol red might not be the (only) culprit, I am not seeing any neutrophil killing activity (ADCC assay).
    I plan to attempt the method provided in this video later this week. Any ideas about phenol red?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 9:58 AM
  14. We avoid pH indicator dyes because they often cause autofluorescence and lead to high background in fluorescent assays. We don't have any direct measurements of fluorescent dyes on neutrophil function.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 10:10 AM
  15. I have seen that during neutrophil isolation from my blood there is no layer of neutrophils while there is a thick band of ruptured RBC at that position,every time.Can anyone suggest me,what could be the reason for that?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2012 - 4:25 AM
  16. I'm getting the same result every time. Did you ever find out what's causing a thick band of RBC at the position of neutrophils bands?

    Reply
    Posted by: Zahra M.
    February 17, 2014 - 12:23 PM
  17. I have been in face of the same problem that part of RBC can not sediment to the bottom band. This almost happpens when centrifuging at 500RCF but hardly happen at 450 RCF. So I guess 500 RCF is inappropriate.

    Reply
    Posted by: Xu L.
    May 25, 2017 - 3:50 AM
  18. Is this protocol applicable to Dog and Rat Neutrophil isolation? If so, do I still use HSA?

    Reply
    Posted by: Vishnu U.
    June 27, 2012 - 3:04 PM
  19. I have a similar question. I am interested in using this protocol to isolate neutrophils from mouse whole blood. Did you ever find out if this protocol works for rat neutrophil isolation?

    Reply
    Posted by: Hanna M.
    January 29, 2014 - 1:59 PM
  20. Hi. It is said in the article that the neutrophil yield would be 2x10^6 per ml. Does that mean 2x10^6 per ml of whole blood used? So using 5 ml of blood (as used in the article) would yield 10 million neutrophils?
    I got an extremely low count for my neutrophils. about 2 million from 5ml blood. Can you please help me troubleshoot?
    Also, why did you mention 10-15ml blood (yielding x10^8 cells) in the beginning? Is it that you carry out the isolation from 10-15 ml blood in 2 or 3 parts of 5 ml each? Please help.
    Thanks.

    Reply
    Posted by: Sumana B.
    September 25, 2014 - 3:17 PM
  21. I a following this protocol, but running into clumping of the cells. Is there any way to prevent this from happening?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2017 - 9:52 PM

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