好中球単離プロトコル

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

好中球は炎症性免疫応答のサイトに到着する最初のセルの一つです、そしてその機能とメカニズムをin vitroで広く研究されている。我々は、市販の分離媒体を用いて全血からヒト好中球を分離するために標準の密度勾配分離法を示しています。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

好中球多形核顆粒球(PMN)はヒトおよび炎症性免疫応答のサイトに到着する最初のセルの中で最も豊富に存在する白血球である。炎症におけるそれらの重要な役割のために、このような運動、サイトカイン産生、貪食、および腫瘍細胞の戦闘などの好中球の機能は広範囲に研究されています。好中球が短命であり、コレクションの2-4時間以内に使用すべきである特に以来、好中球の特定の機能を特徴づけるために、他の血液細胞からそれらを分離する、クリーンで高速、かつ信頼性の高い方法は、in vitro試験が望ましい。ここで、我々は、ナトリウムmetrizoateとデキストラン500の混合物である市販の分離媒体を用いて全血からヒト好中球を分離するために標準の密度勾配分離法を示しています。手順は、密度勾配媒体上階層化全血を、遠心分離、好中球層の分離、および残存赤血球の溶解で構成されています。次いで、細胞を洗浄しカウント、および所望の濃度の緩衝液に再懸濁されている。正しく実行する場合、このメソッドは> 95%の生存率で> 95%の好中球のサンプルを得ることが示されている。

Protocol

好中球単離プロトコル

  1. 室温にすべての試薬をもたらす。
  2. 遠心分離管に好中球分離培地5.0 mlを収集する。分離媒体上に血の慎重層5.0 mlである。ゆっくりと慎重に、そして血液やメディアの混在を防ぐためにメディアの表面に近いピペットの先端で、この手順を実行します。
  3. 20〜25時35分、500 RCFで遠心℃、血漿、単球、分離培地、好中球、より多くの分離培地、および赤血球細胞ペレット(図1):血液は、6つの異なるバンドに出て分離する必要があります。これらのバンドが明確でない場合は、分離プロセスは、クリーンではなかったと繰り返される必要があります。
  4. 慎重にピペットを使用して、上位3階層を(プラズマ、単球、および分離培地)を取り外します。これらの層を廃棄してください。
  5. 慎重に好中球と好中球の下に分離媒体のすべての層をピペットで。新しい遠心チューブにソリューションを配置。
  6. のCa 2 + / Mg 2 +をせずにHBSSで10mlへの好中球希薄溶液。細胞を中断するチューブを数回転倒。
  7. 10分350 RCFで好中球ソリューションを遠心分離します。赤色のペレットは、好中球と残留赤血球(RBC)を含む、チューブの底に存在すべきである。慎重にペレットが乱されていないことをピペットで上清を取り除きます。
  8. 残留赤血球を溶解するために、チューブに2ミリリットル赤血球溶解バッファーを追加します。ペレット、渦3-4設定でバイアルを再懸濁させる。これは好中球が活性化する原因となりますので、4の上に渦の設定値を増加させることは避けてください。それは数秒間ボルテックスに必要になることがあります、またはペレットを溶解するために渦を"パルス"へ。
  9. 5分の250 RCFでチューブを遠心分離します。ピペットで上清を取り除きます。必要に応じて、溶解プロセスを繰り返します。
  10. のCa 2 + / Mgの2を使わずに 500μlのHBSSを追加する+各チューブに。再び、渦は3-4の設定でペレットを再懸濁します。のCa 2 + / Mg 2 +をせずにHBSSで10mlに希釈する。
  11. 5分の250 RCFでチューブを遠心する。上清を吸引して捨てます。
  12. 250μlのHBSS / HSAの溶液(2%HSA)でペレットを再懸濁する。次いで、細胞を計数し、所望の濃度に調節することができる。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

密度勾配分離法は、ナトリウムmetrizoateとデキストラン500の混合物を用いて全血からヒト好中球を分離するために使用されます。このメソッドは、フェランテとトーン(1980)による好中球を分離するために変更されたBoyum(1968)によって単核白血球分離法に基づいています。

ドナーから収集した後、全血は、EDTA、クエン酸、またはヘパリンで抗凝固することができます。彼らは短命なので、好中球は、コレクションの2〜4時間以内にご使用ください。手順は、密度勾配媒体上階層化全血を、遠心分離、好中球層の分離、および残存赤血球の溶解で構成されています。次いで、細胞を洗浄し、計数し、所望の濃度に再懸濁する。

6バンドが最初の遠心分離工程の後に異なるでない場合は、分離プロセスは、クリーンではなかったと繰り返される必要があります。明確に分離、分離培地の有効期限が切れたり、汚染されていないことを確認してください。献血者は採血前72時間以内にアルコールや薬を消費した場合の分離にも失敗する場合があります。

分離操作中に好中球活性化を防ぐために、それはカルシウムなしでHBSSを使用するのが最適です+ / Mg2 +の、イオンが主要な細胞が示されているから。ペレットの再懸濁も徐々に実施すべきである、と細胞が活性化にならないように渦の設定は、ミッドレンジからローに維持する必要があります。

正しく実行する場合、このメソッドは> 95%の生存率で> 95%の好中球のサンプルを得ることが示されている。純度および生存性は、好中球特異的マーカーCD66b及びトリパンブルー色素排除で細胞を標識することにより評価することができます。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

NIH R01 HL56621から資金調達。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Poly(R) Reagent Cedarlane Labs PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride Reagent Invitrogen
Human Serum Albumin Reagent ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer Reagent Roche Group
Centrifuge Tool
Vortexer Tool
Pasteur Pipettes and bulb Tool
PolymorphprepTM Reagent Axis-Shield Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter Other EMD Millipore SLGV033RS Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride Reagent Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).

Comments

21 Comments

  1. what is the rational for using whole blood instead of purified white blood cells or enriched neutrophils for NBT test???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 28, 2008 - 12:37 PM
  2. Why must HSA and not BSA be used? Do you have references for the effect of ETOH and drugs on separation success, and mechanism of action?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 29, 2008 - 11:21 AM
  3. BSA can activate neutrophils. Brian Siano, on behalf of Hana Oh and Scott Diamond

    Reply
    Posted by: Brian S.
    October 29, 2008 - 11:43 AM
  4. How many HBSS and how many HSA need for HBSS/HSA solution preparation?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 21, 2009 - 2:50 PM
  5. hi, why do you use HSA? or what is the action of HSA in buffer?  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 10, 2009 - 3:14 AM
  6. so many things contradict in the movie vs your text

    Reply
    Posted by: Laura K.
    December 4, 2009 - 4:00 PM
  7. From JoVE editor: video and text are complementary parts of each video-article. They are not necessarily 100% the same. There are things that are better described in video than in text, and vice versa. I think in this case the video part is very comprehensive and provides a very clear demonstration on how to do the experiment.

    Reply
    Posted by: Moshe P.
    December 7, 2009 - 3:22 PM
  8. Are there any other reasons why one will not get 6 bands of separation using Polymorphprep? My separation is still not perfect. Repeatign causes the monocyte layer to lower towards the neutrophils. Any suggestions? Donor blood is not affected as mentioned in your video.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2010 - 11:28 PM
  9. Any suggestions of modify this protocol so that it will work with NHP blood?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2011 - 6:36 PM
  10. Why is ²% HSA added in the last step? What is the advantage of doing that? And what happens is I dont add it?

    Reply
    Posted by: Alex B.
    July 6, 2011 - 3:59 AM
  11. DŒs HBBS for HBBS/HSA preparation contain Ca AND Mg or only Ca?

    Reply
    Posted by: Marija P.
    November 3, 2011 - 3:20 PM
  12. I believe the question above refers to the last step of resuspension of neutrophils. At this point you could use various types of buffer solutions that suite your specific experimental goals. If trying to create a suspension of neutrophils in a physiological saline buffer, both Ca and Mg can be added.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 3:27 PM
  13. I notice that the HBSS contains no phenol red in your neutrophil isolation method. I have noticed that phenol red is avoided (both during isolation and during experiments) in a number of papers implementing neutrophil isolation techniques. Any idea what phenol red dŒs to neutrophils? I have used a variation on the isolation technique (generously shared by Drs. Oh, Siano and Diamond) and ended by suspending my isolated neutrophils in RPMI with phenol red. Although phenol red might not be the (only) culprit, I am not seeing any neutrophil killing activity (ADCC assay).
    I plan to attempt the method provided in this video later this week. Any ideas about phenol red?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 9:58 AM
  14. We avoid pH indicator dyes because they often cause autofluorescence and lead to high background in fluorescent assays. We don't have any direct measurements of fluorescent dyes on neutrophil function.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 10:10 AM
  15. I have seen that during neutrophil isolation from my blood there is no layer of neutrophils while there is a thick band of ruptured RBC at that position,every time.Can anyone suggest me,what could be the reason for that?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2012 - 4:25 AM
  16. I'm getting the same result every time. Did you ever find out what's causing a thick band of RBC at the position of neutrophils bands?

    Reply
    Posted by: Zahra M.
    February 17, 2014 - 12:23 PM
  17. I have been in face of the same problem that part of RBC can not sediment to the bottom band. This almost happpens when centrifuging at 500RCF but hardly happen at 450 RCF. So I guess 500 RCF is inappropriate.

    Reply
    Posted by: Xu L.
    May 25, 2017 - 3:50 AM
  18. Is this protocol applicable to Dog and Rat Neutrophil isolation? If so, do I still use HSA?

    Reply
    Posted by: Vishnu U.
    June 27, 2012 - 3:04 PM
  19. I have a similar question. I am interested in using this protocol to isolate neutrophils from mouse whole blood. Did you ever find out if this protocol works for rat neutrophil isolation?

    Reply
    Posted by: Hanna M.
    January 29, 2014 - 1:59 PM
  20. Hi. It is said in the article that the neutrophil yield would be 2x10^6 per ml. Does that mean 2x10^6 per ml of whole blood used? So using 5 ml of blood (as used in the article) would yield 10 million neutrophils?
    I got an extremely low count for my neutrophils. about 2 million from 5ml blood. Can you please help me troubleshoot?
    Also, why did you mention 10-15ml blood (yielding x10^8 cells) in the beginning? Is it that you carry out the isolation from 10-15 ml blood in 2 or 3 parts of 5 ml each? Please help.
    Thanks.

    Reply
    Posted by: Sumana B.
    September 25, 2014 - 3:17 PM
  21. I a following this protocol, but running into clumping of the cells. Is there any way to prevent this from happening?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2017 - 9:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics