Aislamiento de neutrófilos Protocolo

Biology

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Summary

Los neutrófilos se encuentran entre las primeras células en llegar al sitio de la respuesta inmune inflamatoria, y sus funciones y mecanismos han sido ampliamente estudiados in vitro. Se demuestra un gradiente de densidad estándar método de separación para aislar los neutrófilos humanos de sangre entera utilizando los medios disponibles en el mercado de separación.

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Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).

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Abstract

Granulocitos neutrófilos polimorfonucleares (PMN) son los leucocitos más abundantes en los seres humanos y entre las primeras células en llegar al sitio de la respuesta inmune inflamatoria. Debido a su papel clave en la inflamación, las funciones de los neutrófilos como la locomoción, la producción de citoquinas, fagocitosis, y combatir las células tumorales son ampliamente estudiados. Para la caracterización de las funciones específicas de los neutrófilos, un método limpio, rápido y confiable de que los separa de otras células sanguíneas es deseable que los estudios in vitro, sobre todo porque los neutrófilos son de corta duración y deben ser utilizados dentro de 2-4 horas de su recolección. Este sentido, demuestran un gradiente de densidad estándar método de separación para aislar los neutrófilos humanos de sangre entera utilizando los medios disponibles en el mercado de separación que es una mezcla de sodio y metrizoato Dextran 500. El procedimiento consiste en capas de sangre entera en el medio de gradiente de densidad, centrifugación, separación de la capa de neutrófilos, y la lisis de los eritrocitos residual. Las células se lavan, se cuentan y se resuspendieron en tampón de concentración que se desee. Cuando se realiza correctamente, este método ha demostrado que el rendimiento de las muestras de> 95% de neutrófilos con la viabilidad> 95%.

Protocol

Aislamiento de neutrófilos Protocolo

  1. Mantener los reactivos a temperatura ambiente.
  2. Recoger 5,0 ml de medios de aislamiento de los neutrófilos en tubo de centrífuga. Cuidadosamente la capa de 5,0 ml de sangre sobre los medios de separación. Realizar este paso, lenta y cuidadosamente, y con la punta de la pipeta cerca de la superficie de los medios de comunicación para evitar la mezcla de la sangre y los medios de comunicación.
  3. Centrifugar a 500 RCF durante 35 minutos a 20-25 ° C. La sangre se debe separar en 6 secciones distintas: el plasma, los monocitos, los medios de aislamiento, los neutrófilos, más medios de aislamiento, y el pellet de glóbulos rojos (Figura 1). Si estas bandas no están claras, el proceso de separación no estaba limpia, y tendrá que ser repetido.
  4. Retire con cuidado la parte superior de tres capas (plasma, los monocitos, y los medios de aislamiento) con una pipeta. Disponer de estas capas.
  5. Pipeta cuidadosamente la capa de neutrófilos y todos los medios de aislamiento por debajo de los neutrófilos. Ponga la solución en un tubo de centrífuga limpio.
  6. Diluir la solución de los neutrófilos a 10 ml con HBSS sin Ca 2 + / Mg 2 +. Invertir el tubo varias veces para suspender las células.
  7. Centrifugar la solución de los neutrófilos a 350 RCF durante 10 minutos. Una pastilla de color rojo debe estar presente en la parte inferior del tubo, que contiene los neutrófilos y los residuos de glóbulos rojos (GR). Eliminar el sobrenadante con una pipeta con cuidado para que la pastilla no se altera.
  8. La lisis de los glóbulos rojos residual, agregar 2 ml Red tampón de lisis celular en el tubo. Para resuspender el precipitado y agitar el vial en un ajuste de 4.3. Evitar el aumento de la configuración de vórtice por encima de 4, ya que esto puede causar a los neutrófilos para activar. Puede que sea necesario para vórtice durante varios segundos, o "pulso" de la vorágine de disolver el precipitado.
  9. Centrifugar el tubo a 250 RCF durante 5 min. Eliminar el sobrenadante con una pipeta. Repita el proceso de lisis, si es necesario.
  10. Añadir 500 l HBSS sin Ca 2 + / Mg 2 + en cada tubo. Una vez más, vortex para resuspender el precipitado en un ajuste de 4.3. Diluir a 10 ml con HBSS sin Ca 2 + / Mg 2 +.
  11. Centrifugar los tubos a 250 RCF durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y desecharlo.
  12. Resuspender el precipitado en 250 HBSS l / Solución de HSA (2% HSA). Las células se pueden contar y se ajusta a la concentración deseada.

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Discussion

El gradiente de densidad método de separación se utiliza para aislar los neutrófilos humanos de sangre total usando una mezcla de sodio y metrizoato Dextran 500. Este método se basa en el método de separación de leucocitos mononucleares por Boyum (1968), que fue modificada para la separación de los neutrófilos por Ferrante y Correa (1980).

Después de la recolección de un donante, la sangre entera pueden ser anticoagulados con EDTA, citrato o heparina. Ya que son de corta duración, los neutrófilos se debe utilizar dentro de 2-4 horas de su recolección. El procedimiento consiste en capas de sangre entera en el medio de gradiente de densidad, centrifugación, separación de la capa de neutrófilos, y la lisis de los eritrocitos residual. Las células se lavan, se cuentan y se resuspendieron a la concentración deseada.

Si los seis bandas no son distintas después de la primera centrifugación, el proceso de separación no estaba limpia, y tendrá que ser repetido. Para la separación limpia, asegúrese de que los medios de comunicación de aislamiento no ha expirado o están contaminados. La separación también puede no realizarse si el donante de sangre ha consumido alcohol o medicamentos en las 72 horas previas a la extracción de sangre.

Para evitar la activación de neutrófilos durante el proceso de separación, lo mejor es utilizar HBSS sin Ca2 + / Mg2 +, ya que los iones se ha demostrado que las células principales. Resuspensión de pellets también se debe realizar lentamente, y la configuración de vórtice debe mantenerse en el bajo y medio régimen para que las células no se activan.

Cuando se realiza correctamente, este método ha demostrado que el rendimiento de las muestras de> 95% de neutrófilos con la viabilidad> 95%. La pureza y la viabilidad puede ser evaluada por el etiquetado de las células con neutrófilos marcador específico CD66b y tripan exclusión del colorante azul.

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Acknowledgments

Financiación de los NIH R01 HL56621.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Poly(R) Reagent Cedarlane Labs PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride Reagent Invitrogen
Human Serum Albumin Reagent ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer Reagent Roche Group
Centrifuge Tool
Vortexer Tool
Pasteur Pipettes and bulb Tool
PolymorphprepTM Reagent Axis-Shield Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter Other EMD Millipore SLGV033RS Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride Reagent Invitrogen

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References

  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).

Comments

21 Comments

  1. what is the rational for using whole blood instead of purified white blood cells or enriched neutrophils for NBT test???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 28, 2008 - 12:37 PM
  2. Why must HSA and not BSA be used? Do you have references for the effect of ETOH and drugs on separation success, and mechanism of action?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 29, 2008 - 11:21 AM
  3. BSA can activate neutrophils. Brian Siano, on behalf of Hana Oh and Scott Diamond

    Reply
    Posted by: Brian S.
    October 29, 2008 - 11:43 AM
  4. How many HBSS and how many HSA need for HBSS/HSA solution preparation?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 21, 2009 - 2:50 PM
  5. hi, why do you use HSA? or what is the action of HSA in buffer?  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 10, 2009 - 3:14 AM
  6. so many things contradict in the movie vs your text

    Reply
    Posted by: Laura K.
    December 4, 2009 - 4:00 PM
  7. From JoVE editor: video and text are complementary parts of each video-article. They are not necessarily 100% the same. There are things that are better described in video than in text, and vice versa. I think in this case the video part is very comprehensive and provides a very clear demonstration on how to do the experiment.

    Reply
    Posted by: Moshe P.
    December 7, 2009 - 3:22 PM
  8. Are there any other reasons why one will not get 6 bands of separation using Polymorphprep? My separation is still not perfect. Repeatign causes the monocyte layer to lower towards the neutrophils. Any suggestions? Donor blood is not affected as mentioned in your video.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2010 - 11:28 PM
  9. Any suggestions of modify this protocol so that it will work with NHP blood?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2011 - 6:36 PM
  10. Why is ²% HSA added in the last step? What is the advantage of doing that? And what happens is I dont add it?

    Reply
    Posted by: Alex B.
    July 6, 2011 - 3:59 AM
  11. DŒs HBBS for HBBS/HSA preparation contain Ca AND Mg or only Ca?

    Reply
    Posted by: Marija P.
    November 3, 2011 - 3:20 PM
  12. I believe the question above refers to the last step of resuspension of neutrophils. At this point you could use various types of buffer solutions that suite your specific experimental goals. If trying to create a suspension of neutrophils in a physiological saline buffer, both Ca and Mg can be added.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 3:27 PM
  13. I notice that the HBSS contains no phenol red in your neutrophil isolation method. I have noticed that phenol red is avoided (both during isolation and during experiments) in a number of papers implementing neutrophil isolation techniques. Any idea what phenol red dŒs to neutrophils? I have used a variation on the isolation technique (generously shared by Drs. Oh, Siano and Diamond) and ended by suspending my isolated neutrophils in RPMI with phenol red. Although phenol red might not be the (only) culprit, I am not seeing any neutrophil killing activity (ADCC assay).
    I plan to attempt the method provided in this video later this week. Any ideas about phenol red?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 9:58 AM
  14. We avoid pH indicator dyes because they often cause autofluorescence and lead to high background in fluorescent assays. We don't have any direct measurements of fluorescent dyes on neutrophil function.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 10:10 AM
  15. I have seen that during neutrophil isolation from my blood there is no layer of neutrophils while there is a thick band of ruptured RBC at that position,every time.Can anyone suggest me,what could be the reason for that?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2012 - 4:25 AM
  16. I'm getting the same result every time. Did you ever find out what's causing a thick band of RBC at the position of neutrophils bands?

    Reply
    Posted by: Zahra M.
    February 17, 2014 - 12:23 PM
  17. I have been in face of the same problem that part of RBC can not sediment to the bottom band. This almost happpens when centrifuging at 500RCF but hardly happen at 450 RCF. So I guess 500 RCF is inappropriate.

    Reply
    Posted by: Xu L.
    May 25, 2017 - 3:50 AM
  18. Is this protocol applicable to Dog and Rat Neutrophil isolation? If so, do I still use HSA?

    Reply
    Posted by: Vishnu U.
    June 27, 2012 - 3:04 PM
  19. I have a similar question. I am interested in using this protocol to isolate neutrophils from mouse whole blood. Did you ever find out if this protocol works for rat neutrophil isolation?

    Reply
    Posted by: Hanna M.
    January 29, 2014 - 1:59 PM
  20. Hi. It is said in the article that the neutrophil yield would be 2x10^6 per ml. Does that mean 2x10^6 per ml of whole blood used? So using 5 ml of blood (as used in the article) would yield 10 million neutrophils?
    I got an extremely low count for my neutrophils. about 2 million from 5ml blood. Can you please help me troubleshoot?
    Also, why did you mention 10-15ml blood (yielding x10^8 cells) in the beginning? Is it that you carry out the isolation from 10-15 ml blood in 2 or 3 parts of 5 ml each? Please help.
    Thanks.

    Reply
    Posted by: Sumana B.
    September 25, 2014 - 3:17 PM
  21. I a following this protocol, but running into clumping of the cells. Is there any way to prevent this from happening?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2017 - 9:52 PM

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