Isolement des neutrophiles Protocole

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Les neutrophiles sont parmi les premières cellules à arriver sur le site de la réponse immunitaire inflammatoire, et de leurs fonctions et mécanismes ont été largement étudiés in vitro. Nous démontrons une méthode de gradient de densité standard de séparation pour isoler les neutrophiles humains du sang total en utilisant des milieux de séparation disponibles commercialement.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Neutrophiles polynucléaires neutrophiles (PMN) sont les leucocytes les plus abondants chez les humains et chez les premières cellules à arriver sur le site de la réponse immunitaire inflammatoire. En raison de leur rôle clé dans l'inflammation, les fonctions des neutrophiles tels que la locomotion, la production de cytokines, la phagocytose, et lutter contre des cellules tumorales sont largement étudiés. Afin de caractériser les fonctions spécifiques des neutrophiles, une méthode propre, rapide, fiable et de les séparer des autres cellules sanguines est souhaitable pour des études in vitro, en particulier depuis les neutrophiles sont de courte durée et doit être utilisé dans 2-4 heures de la collecte. Ici, nous démontrons une méthode de gradient de densité standard de séparation pour isoler les neutrophiles humains du sang total à l'aide des médias disponibles dans le commerce de séparation qui est un mélange de sodium et de métrizoate Dextran 500. La procédure se compose de couches de sang entier sur le moyen gradient de densité, la centrifugation, la séparation de la couche de neutrophiles, et la lyse des hématies résiduelles. Les cellules sont ensuite lavées, comptées et resuspendues dans un tampon à la concentration voulue. Quand elle est réalisée correctement, cette méthode a été démontré que le rendement des échantillons de> 95% des neutrophiles avec la viabilité> 95%.

Protocol

Isolement des neutrophiles Protocole

  1. Amener tous les réactifs à température ambiante.
  2. Collecter 5,0 ml de milieux d'isolement des neutrophiles dans le tube de la centrifugeuse. Soigneusement couche de 5,0 ml de sang sur les médias de séparation. Effectuez cette étape lentement et soigneusement, et avec la pointe de la pipette à proximité de la surface du média pour éviter de mélanger le sang et les médias.
  3. Centrifuger à 500 RCF pendant 35 min à 20-25 ° C. Le sang doit se séparer en 6 bandes distinctes: le plasma, les monocytes, les milieux d'isolement, les neutrophiles, des milieux d'isolement de plus, et les globules rouges culot (figure 1). Si ces bandes ne sont pas claires, le processus de séparation n'était pas propre et aura besoin d'être répété.
  4. Retirer délicatement les trois couches supérieures (plasma, des monocytes et des milieux d'isolement) en utilisant une pipette. Eliminer ces couches.
  5. Soigneusement pipette la couche de neutrophiles et de l'ensemble des milieux d'isolement sous les neutrophiles. Placer la solution dans un tube à centrifuger propre.
  6. Diluer la solution des neutrophiles à 10 ml avec HBSS sans Ca 2 + / Mg 2 +. Inverser le tube à quelques reprises de suspendre les cellules.
  7. Centrifuger la solution des neutrophiles à 350 RCF pendant 10 minutes. Une pastille rouge doit être présent au fond du tube, contenant des neutrophiles et des résidus de globules rouges (hématies). Enlever le surnageant avec une pipette avec soin afin que le culot n'est pas perturbé.
  8. Pour lyser les globules rouges résiduels, ajouter 2 ml de tampon de lyse des érythrocytes au tube. Pour resuspendre le culot, vortex le flacon à un réglage de 3-4. Évitez d'augmenter le réglage de vortex au-dessus de 4, car cela pourrait provoquer des neutrophiles pour l'activer. Il peut être nécessaire de vortex pendant quelques secondes, ou de «pouls» du vortex pour dissoudre le culot.
  9. Centrifuger le tube à 250 RCF pendant 5 min. Enlever le surnageant avec une pipette. Répétez le processus de lyse, si nécessaire.
  10. Ajouter 500 ul de HBSS sans Ca 2 + / Mg 2 + dans chaque tube. Encore une fois, vortex pour remettre le culot à un réglage de 3-4. Diluer à 10 ml avec HBSS sans Ca 2 + / Mg 2 +.
  11. Centrifuger les tubes à 250 RCF pendant 5 min. Aspirer le surnageant et le jeter.
  12. Reprendre le culot dans 250 ul de HBSS / Solution HSA (2% HSA). Les cellules peuvent ensuite être comptés et ajusté à la concentration voulue.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La méthode de séparation en gradient de densité est utilisée pour isoler les neutrophiles humains du sang total en utilisant un mélange de sodium et de métrizoate Dextran 500. Cette méthode est basée sur la méthode de séparation des leucocytes mononucléaires par Boyum (1968) qui a été modifiée pour la séparation des neutrophiles par Ferrante et Thong (1980).

Après la collecte d'un donneur, du sang entier anticoagulé peut être avec de l'EDTA, du citrate ou héparine. Comme ils sont de courte durée, les neutrophiles doit être utilisé dans 2-4 heures de la collecte. La procédure se compose de couches de sang entier sur le moyen gradient de densité, la centrifugation, la séparation de la couche de neutrophiles, et la lyse des hématies résiduelles. Les cellules sont ensuite lavées, comptées et remises en suspension à la concentration voulue.

Si les six bandes ne sont pas distinctes après la première phase de centrifugation, le processus de séparation n'était pas propre et aura besoin d'être répété. Pour la séparation propre, assurez-vous que les médias l'isolement n'est pas expirée ou contaminée. La séparation peut également être infructueuse si les donneurs de sang a consommé de l'alcool ou des médicaments dans les 72 heures précédant la collecte de sang.

Pour empêcher l'activation des neutrophiles au cours de la procédure de séparation, il est préférable d'utiliser HBSS sans Ca2 + / Mg2 +, car les ions a été démontré que les cellules préférentiel. Remise en suspension de granules devrait également être effectuée lentement, et les paramètres de vortex doivent être conservés dans le bas-milieu de gamme afin que les cellules ne deviennent pas activé.

Quand elle est réalisée correctement, cette méthode a été démontré que le rendement des échantillons de> 95% des neutrophiles avec la viabilité> 95%. Pureté et la viabilité peut être évaluée par marquage des cellules avec des neutrophiles marqueur spécifique CD66b et l'exclusion du colorant bleu trypan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Le financement du NIH R01 HL56621.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Poly(R) Reagent Cedarlane Labs PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride Reagent Invitrogen
Human Serum Albumin Reagent ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer Reagent Roche Group
Centrifuge Tool
Vortexer Tool
Pasteur Pipettes and bulb Tool
PolymorphprepTM Reagent Axis-Shield Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter Other EMD Millipore SLGV033RS Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride Reagent Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).

Comments

21 Comments

  1. what is the rational for using whole blood instead of purified white blood cells or enriched neutrophils for NBT test???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 28, 2008 - 12:37 PM
  2. Why must HSA and not BSA be used? Do you have references for the effect of ETOH and drugs on separation success, and mechanism of action?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 29, 2008 - 11:21 AM
  3. BSA can activate neutrophils. Brian Siano, on behalf of Hana Oh and Scott Diamond

    Reply
    Posted by: Brian S.
    October 29, 2008 - 11:43 AM
  4. How many HBSS and how many HSA need for HBSS/HSA solution preparation?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 21, 2009 - 2:50 PM
  5. hi, why do you use HSA? or what is the action of HSA in buffer?  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 10, 2009 - 3:14 AM
  6. so many things contradict in the movie vs your text

    Reply
    Posted by: Laura K.
    December 4, 2009 - 4:00 PM
  7. From JoVE editor: video and text are complementary parts of each video-article. They are not necessarily 100% the same. There are things that are better described in video than in text, and vice versa. I think in this case the video part is very comprehensive and provides a very clear demonstration on how to do the experiment.

    Reply
    Posted by: Moshe P.
    December 7, 2009 - 3:22 PM
  8. Are there any other reasons why one will not get 6 bands of separation using Polymorphprep? My separation is still not perfect. Repeatign causes the monocyte layer to lower towards the neutrophils. Any suggestions? Donor blood is not affected as mentioned in your video.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2010 - 11:28 PM
  9. Any suggestions of modify this protocol so that it will work with NHP blood?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2011 - 6:36 PM
  10. Why is ²% HSA added in the last step? What is the advantage of doing that? And what happens is I dont add it?

    Reply
    Posted by: Alex B.
    July 6, 2011 - 3:59 AM
  11. DŒs HBBS for HBBS/HSA preparation contain Ca AND Mg or only Ca?

    Reply
    Posted by: Marija P.
    November 3, 2011 - 3:20 PM
  12. I believe the question above refers to the last step of resuspension of neutrophils. At this point you could use various types of buffer solutions that suite your specific experimental goals. If trying to create a suspension of neutrophils in a physiological saline buffer, both Ca and Mg can be added.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 3:27 PM
  13. I notice that the HBSS contains no phenol red in your neutrophil isolation method. I have noticed that phenol red is avoided (both during isolation and during experiments) in a number of papers implementing neutrophil isolation techniques. Any idea what phenol red dŒs to neutrophils? I have used a variation on the isolation technique (generously shared by Drs. Oh, Siano and Diamond) and ended by suspending my isolated neutrophils in RPMI with phenol red. Although phenol red might not be the (only) culprit, I am not seeing any neutrophil killing activity (ADCC assay).
    I plan to attempt the method provided in this video later this week. Any ideas about phenol red?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 9:58 AM
  14. We avoid pH indicator dyes because they often cause autofluorescence and lead to high background in fluorescent assays. We don't have any direct measurements of fluorescent dyes on neutrophil function.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 10:10 AM
  15. I have seen that during neutrophil isolation from my blood there is no layer of neutrophils while there is a thick band of ruptured RBC at that position,every time.Can anyone suggest me,what could be the reason for that?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2012 - 4:25 AM
  16. I'm getting the same result every time. Did you ever find out what's causing a thick band of RBC at the position of neutrophils bands?

    Reply
    Posted by: Zahra M.
    February 17, 2014 - 12:23 PM
  17. I have been in face of the same problem that part of RBC can not sediment to the bottom band. This almost happpens when centrifuging at 500RCF but hardly happen at 450 RCF. So I guess 500 RCF is inappropriate.

    Reply
    Posted by: Xu L.
    May 25, 2017 - 3:50 AM
  18. Is this protocol applicable to Dog and Rat Neutrophil isolation? If so, do I still use HSA?

    Reply
    Posted by: Vishnu U.
    June 27, 2012 - 3:04 PM
  19. I have a similar question. I am interested in using this protocol to isolate neutrophils from mouse whole blood. Did you ever find out if this protocol works for rat neutrophil isolation?

    Reply
    Posted by: Hanna M.
    January 29, 2014 - 1:59 PM
  20. Hi. It is said in the article that the neutrophil yield would be 2x10^6 per ml. Does that mean 2x10^6 per ml of whole blood used? So using 5 ml of blood (as used in the article) would yield 10 million neutrophils?
    I got an extremely low count for my neutrophils. about 2 million from 5ml blood. Can you please help me troubleshoot?
    Also, why did you mention 10-15ml blood (yielding x10^8 cells) in the beginning? Is it that you carry out the isolation from 10-15 ml blood in 2 or 3 parts of 5 ml each? Please help.
    Thanks.

    Reply
    Posted by: Sumana B.
    September 25, 2014 - 3:17 PM
  21. I a following this protocol, but running into clumping of the cells. Is there any way to prevent this from happening?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2017 - 9:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics