Neutrofili isolamento Protocollo

Biology

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Summary

I neutrofili sono tra le prime cellule ad arrivare sul luogo del infiammatoria risposta immunitaria, e le loro funzioni e meccanismi sono stati ampiamente studiata in vitro. Si dimostra uno standard gradiente di densità metodo di separazione per isolare neutrofili umani da sangue intero utilizzando mezzi di separazione disponibili in commercio.

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Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).

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Abstract

Granulociti neutrofili polimorfonucleati (PMN) sono i leucociti più abbondanti negli esseri umani e tra le prime cellule ad arrivare sul luogo del infiammatoria risposta immunitaria. A causa del loro ruolo chiave nel processo infiammatorio, le funzioni dei neutrofili come locomozione, la produzione di citochine, fagocitosi, e combattere cellule tumorali sono ampiamente studiati. Per caratterizzare le funzioni specifiche di neutrofili, un metodo pulito, veloce e affidabile che li separa dai globuli altro è auspicabile che studi in vitro, specialmente da quando i neutrofili sono di breve durata e deve essere utilizzato entro 2-4 ore dalla raccolta. Qui, dimostrare un metodo standard di gradiente di densità di separazione per isolare neutrofili umani da sangue intero utilizzando mezzi di separazione disponibile in commercio che è una miscela di sodio metrizoate e Destrano 500. La procedura consiste di sangue intero stratificazione nel medio gradiente di densità, centrifugazione, separazione dello strato dei neutrofili, e lisi degli eritrociti residui. Le cellule vengono poi lavate, contate e risospese in tampone alla concentrazione desiderata. Quando eseguito correttamente, questo metodo ha dimostrato di produrre campioni di> neutrofili 95% con vitalità> 95%.

Protocol

Neutrofili isolamento Protocollo

  1. Portare i reagenti a temperatura ambiente.
  2. Raccogliere 5,0 ml di terreni di isolamento dei neutrofili in provetta da centrifuga. Con attenzione strato 5,0 ml di sangue sui mezzi di separazione. Effettuare questo passaggio, lentamente e con attenzione, e con la punta della pipetta vicino alla superficie del supporto per evitare di mescolare il sangue e dei media.
  3. Centrifugare a 500 RCF per 35 minuti a 20-25 ° C. Il sangue deve separare in 6 fasce distinte: al plasma, monociti, terreni di isolamento, i neutrofili, terreni di isolamento di più, e il rosso del sangue pellet cellulare (Figura 1). Se queste bande non sono chiare, il processo di separazione non era pulito e dovrà essere ripetuto.
  4. Rimuovere con attenzione i primi tre strati (plasma, monociti, e terreni di isolamento) usando una pipetta. Smaltire questi strati.
  5. Con attenzione pipetta lo strato di neutrofili e di tutti i terreni di isolamento sotto il neutrofili. Mettere la soluzione in una provetta da centrifuga pulita.
  6. Diluire la soluzione dei neutrofili a 10 ml con HBSS senza Ca 2 + / Mg 2 +. Invertire il tubo di un paio di volte a sospendere le cellule.
  7. Centrifugare la soluzione dei neutrofili a 350 RCF per 10 minuti. Una pallina rossa deve essere presente sul fondo della provetta, contenente residui di neutrofili e globuli rossi (RBC). Eliminare il surnatante con una pipetta attenzione in modo che il pellet non è disturbato.
  8. Per lisare i globuli rossi residuo, aggiungere 2 ml di Lysis Buffer Red Cell per il tubo. Per risospendere il, pellet vortice del flacone in un ambiente di 3-4. Evitare di aumentare l'impostazione vortice superiore a 4, dal momento che questo può causare i neutrofili da attivare. Potrebbe essere necessario vortex per alcuni secondi, o di "impulso" il vortice di sciogliere il pellet.
  9. Centrifugare la provetta a 250 RCF per 5 min. Togliere il surnatante con la pipetta. Ripetere il processo di lisi, se necessario.
  10. Aggiungere 500 microlitri HBSS senza Ca 2 + / Mg 2 + ad ogni provetta. Ancora una volta, vortice per risospendere il pellet in un ambiente di 3-4. Diluire a 10 ml con HBSS senza Ca 2 + / Mg 2 +.
  11. Centrifugare le provette a 250 RCF per 5 min. Aspirare il surnatante e gettarlo.
  12. Risospendere il pellet in 250 microlitri HBSS / Soluzione HSA (2% HSA). Le cellule possono essere contati e regolato concentrazione desiderata.

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Discussion

Il gradiente di densità metodo di separazione viene utilizzato per isolare neutrofili umani da sangue intero con una miscela di sodio metrizoate e Destrano 500. Questo metodo si basa sul metodo di separazione dei leucociti mononucleari da Boyum (1968), che è stato modificato per la separazione dei neutrofili da Ferrante e Thong (1980).

Dopo la raccolta di un donatore, il sangue intero può essere anticoagulato con EDTA, citrato o eparina. Dal momento che sono di breve durata, i neutrofili devono essere utilizzati entro 2-4 ore dalla raccolta. La procedura consiste di sangue intero stratificazione nel medio gradiente di densità, centrifugazione, separazione dello strato dei neutrofili, e lisi degli eritrociti residui. Le cellule vengono poi lavate, contate e risospese alla concentrazione desiderata.

Se sei bande non sono distinte dopo la prima fase di centrifugazione, il processo di separazione non è stata pulita e dovrà essere ripetuto. Per la netta separazione, assicurarsi che i terreni di isolamento non è scaduto o contaminato. La separazione può anche fallire se il donatore di sangue ha consumato alcol o farmaci nelle 72 ore precedenti il ​​prelievo del sangue.

Per evitare l'attivazione dei neutrofili durante la procedura di separazione, è meglio usare HBSS senza Ca2 + / Mg2 +, dal momento che gli ioni hanno dimostrato di cellule primo. Risospensione del pellet deve essere eseguita lentamente, e le impostazioni del vortice dovrebbe essere tenuto in basso a medio raggio in modo che le cellule non si attivano.

Quando eseguito correttamente, questo metodo ha dimostrato di produrre campioni di> neutrofili 95% con vitalità> 95%. La purezza e la vitalità può essere valutata mediante l'etichettatura le cellule con neutrofili specifico marcatore CD66b e trypan esclusione del colorante blu.

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Acknowledgments

Finanziamenti dal NIH R01 HL56621.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Poly(R) Reagent Cedarlane Labs PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride Reagent Invitrogen
Human Serum Albumin Reagent ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer Reagent Roche Group
Centrifuge Tool
Vortexer Tool
Pasteur Pipettes and bulb Tool
PolymorphprepTM Reagent Axis-Shield Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter Other EMD Millipore SLGV033RS Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride Reagent Invitrogen

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References

  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).

Comments

21 Comments

  1. what is the rational for using whole blood instead of purified white blood cells or enriched neutrophils for NBT test???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 28, 2008 - 12:37 PM
  2. Why must HSA and not BSA be used? Do you have references for the effect of ETOH and drugs on separation success, and mechanism of action?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 29, 2008 - 11:21 AM
  3. BSA can activate neutrophils. Brian Siano, on behalf of Hana Oh and Scott Diamond

    Reply
    Posted by: Brian S.
    October 29, 2008 - 11:43 AM
  4. How many HBSS and how many HSA need for HBSS/HSA solution preparation?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 21, 2009 - 2:50 PM
  5. hi, why do you use HSA? or what is the action of HSA in buffer?  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 10, 2009 - 3:14 AM
  6. so many things contradict in the movie vs your text

    Reply
    Posted by: Laura K.
    December 4, 2009 - 4:00 PM
  7. From JoVE editor: video and text are complementary parts of each video-article. They are not necessarily 100% the same. There are things that are better described in video than in text, and vice versa. I think in this case the video part is very comprehensive and provides a very clear demonstration on how to do the experiment.

    Reply
    Posted by: Moshe P.
    December 7, 2009 - 3:22 PM
  8. Are there any other reasons why one will not get 6 bands of separation using Polymorphprep? My separation is still not perfect. Repeatign causes the monocyte layer to lower towards the neutrophils. Any suggestions? Donor blood is not affected as mentioned in your video.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2010 - 11:28 PM
  9. Any suggestions of modify this protocol so that it will work with NHP blood?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2011 - 6:36 PM
  10. Why is ²% HSA added in the last step? What is the advantage of doing that? And what happens is I dont add it?

    Reply
    Posted by: Alex B.
    July 6, 2011 - 3:59 AM
  11. DŒs HBBS for HBBS/HSA preparation contain Ca AND Mg or only Ca?

    Reply
    Posted by: Marija P.
    November 3, 2011 - 3:20 PM
  12. I believe the question above refers to the last step of resuspension of neutrophils. At this point you could use various types of buffer solutions that suite your specific experimental goals. If trying to create a suspension of neutrophils in a physiological saline buffer, both Ca and Mg can be added.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 3:27 PM
  13. I notice that the HBSS contains no phenol red in your neutrophil isolation method. I have noticed that phenol red is avoided (both during isolation and during experiments) in a number of papers implementing neutrophil isolation techniques. Any idea what phenol red dŒs to neutrophils? I have used a variation on the isolation technique (generously shared by Drs. Oh, Siano and Diamond) and ended by suspending my isolated neutrophils in RPMI with phenol red. Although phenol red might not be the (only) culprit, I am not seeing any neutrophil killing activity (ADCC assay).
    I plan to attempt the method provided in this video later this week. Any ideas about phenol red?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 9:58 AM
  14. We avoid pH indicator dyes because they often cause autofluorescence and lead to high background in fluorescent assays. We don't have any direct measurements of fluorescent dyes on neutrophil function.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 10:10 AM
  15. I have seen that during neutrophil isolation from my blood there is no layer of neutrophils while there is a thick band of ruptured RBC at that position,every time.Can anyone suggest me,what could be the reason for that?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2012 - 4:25 AM
  16. I'm getting the same result every time. Did you ever find out what's causing a thick band of RBC at the position of neutrophils bands?

    Reply
    Posted by: Zahra M.
    February 17, 2014 - 12:23 PM
  17. I have been in face of the same problem that part of RBC can not sediment to the bottom band. This almost happpens when centrifuging at 500RCF but hardly happen at 450 RCF. So I guess 500 RCF is inappropriate.

    Reply
    Posted by: Xu L.
    May 25, 2017 - 3:50 AM
  18. Is this protocol applicable to Dog and Rat Neutrophil isolation? If so, do I still use HSA?

    Reply
    Posted by: Vishnu U.
    June 27, 2012 - 3:04 PM
  19. I have a similar question. I am interested in using this protocol to isolate neutrophils from mouse whole blood. Did you ever find out if this protocol works for rat neutrophil isolation?

    Reply
    Posted by: Hanna M.
    January 29, 2014 - 1:59 PM
  20. Hi. It is said in the article that the neutrophil yield would be 2x10^6 per ml. Does that mean 2x10^6 per ml of whole blood used? So using 5 ml of blood (as used in the article) would yield 10 million neutrophils?
    I got an extremely low count for my neutrophils. about 2 million from 5ml blood. Can you please help me troubleshoot?
    Also, why did you mention 10-15ml blood (yielding x10^8 cells) in the beginning? Is it that you carry out the isolation from 10-15 ml blood in 2 or 3 parts of 5 ml each? Please help.
    Thanks.

    Reply
    Posted by: Sumana B.
    September 25, 2014 - 3:17 PM
  21. I a following this protocol, but running into clumping of the cells. Is there any way to prevent this from happening?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2017 - 9:52 PM

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