ثقافة الخلايا الجذعية من الدم النخاعي السلائف نخاع العظم

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

هذا الفيديو يوضح الإجراء للتمييز بين الخلايا الجذعية من نخاع العظم النخاعي الماوس. وأظهرت عزلة الماوس الساق وعظم الفخذ ، ومعالجة نخاع العظم. وتظهر الصور يتظاهرون مورفولوجية الخلية قبل وبعد التمايز ، والشخصيات التي تصور النمط الظاهري الخلية ونضوج IL - 12 الإنتاج التالية باستخدام CPG.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J. Vis. Exp. (17), e769, doi:10.3791/769 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وكثيرا ما تستخدم الخلايا الجذعية النخاعي (DCS) لدراسة التفاعلات بين آليات المناعة الفطرية والتكيف والاستجابة المبكرة للعدوى. لأن هذه هي أقوى مستضد تقديم الخلايا ، ويجري البلدان النامية تستخدم بشكل متزايد كناقل لقاح لدراسة تحريض مستضد محددة الاستجابات المناعية. في هذا الفيديو ، نبدي الداخلي للحصاد وtibias femurs ماوس من المانحين ، ومعالجة نخاع العظم والتفريق البلدان النامية في المختبر. تغيير خصائص البلدان النامية التحفيز التالية : الخلايا الجذعية غير الناضجة هي البالعات قوية ، في حين أن البلدان النامية قادرة على تنضج العرض والتفاعل مع مستضد CD4 + و + CD8 خلايا تي. هذا التغيير في النشاط الوظيفي يتوافق مع upregulation من علامات سطح الخلية والإنتاج خلوى. ويمكن استخدام العديد من وكلاء للبلدان النامية ناضجة ، بما في ذلك السيتوكينات وعدد يغاندس مستقبلات شبيهة. في هذا الفيديو ، ونظهر مقارنات تدفق cytometric للتعبير عن جزيئات تنشيطية شارك في اثنين ، و CD86 CD40 ، وخلوى و، IL - 12 ، في أعقاب التحفيز بين عشية وضحاها مع العلاج CPG أو وهمية. بعد التمايز ، ويمكن التلاعب بها البلدان النامية مزيد من استخدام كناقل لقاح أو لتوليد مستضد محددة الاستجابات المناعية التي ينبض في المختبر باستخدام الببتيدات أو بروتينات أو transduced باستخدام ناقلات فيروسية المؤتلف.

Protocol

وقد تم تكييف هذا البروتوكول من لوتز وآخرون 1

الحصاد ومعالجة نخاع العظم

  1. العزل من الساق والفخذ : الموت ببطء الماوس المانحة ورذاذ الأرجل مع الايثانول 70 ٪. فهم الكاحل first بحزم مع ملقط كليلة والبدء في قطع الجلد والعضلات الكامنة لفضح الساق. لتجنب إتلاف العظام ، وببطء وخفض مواز في الساق ، وترك سليمة مفصل الركبة.

    لتنظيف عظم الفخذ ، لشل حركة مفصل الركبة بواسطة ملقط مع استيعاب حادة. نظيفة بعيدا عن الجهاز العضلي مع زوج من مقص حاد ملقط والمنحنية. تواصل التصاعدي حتى يتم كشف مفصل الورك ويمكن وضعها المقص بين رأس عظم الفخذ ومفصل الورك. إزالة العظام من خلال خفض مشتركة بين عظم الفخذ والورك ومكان في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) على الجليد.
  2. إزالة نخاع العظم : تنظيف الجهاز العضلي المتبقي من العظام باستخدام مقص وملقط منحنية. قطع المشاش كل العظام وتحديد موقع مركز التجويف. استخدام حقنة 10ML محملة PBS و25G0.5 إبرة "، تدفق نخاع العظم في طبق بتري الأنسجة غير المغلفة.
  3. معالجة نخاع العظم : استخدام المطاط في نهاية المكبس من المحاقن 1mL أن تنأى نخاع العظم في تعليق وحيد الخلية (استخدام صعودا وهبوطا ، وليس إلغاء الحركة). جمع نخاع العظم في أنبوب الصقر المخروطية ، وشطف بقايا نخاع العظم مع برنامج تلفزيوني.

ثقافة من الخلايا الجذعية

  1. Resuspend الخلايا في وسائل الاعلام والسلائف العاصمة العد العاصمة على عدادة الكريات (الشكل 1). سترى خلايا ذات أحجام مختلفة ، والسلائف العاصمة هي أكبر وألمع. عد تفاضلي فقط هذه الخلايا. femurs من اثنين واثنين من tibias C57Bl البرية من نوع / 6 الماوس (6-8 أسابيع من العمر) ، يجب أن تتوقع ما بين 25-40 × 10 6 مجموع السلائف العاصمة.



    الشكل 1

  2. ثقافة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 السلائف DC / 5 مل في وسائل الإعلام العاصمة تستكمل مع 40 نانوغرام / مل الفئران المعدلة وراثيا المؤتلف CSF. لوحة الخلايا في الأنسجة غير المغلفة لوحات بتري البوليسترين.

إضافة الوسائط (اليوم 3)

لتحديث وسائل الإعلام ، إضافة نصف الحجم الكلي للسائل الاعلام جديدة تستكمل مع 40 نانوغرام / مل GM - CSF.

استبدال ثلث وسائل الإعلام (يوم 6) ، والنضج

لتحديث وسائل الإعلام ، وإزالة بعناية ثلث إجمالي حجم وسائل الإعلام واستبدالها هذا الحجم مع وسائل الاعلام DC جديدة تستكمل مع 40 نانوغرام / مل GM - CSF في يوم 6 من الثقافة.

إذا رغبت في ذلك ، يمكن أن تحفز الخلايا الجذعية لنضوج باستخدام السيتوكينات أو مستقبلات يغاندس حصيلة شبيهة. في الفيديو ، كانت البلدان النامية التي نضجت التحفيز بين عشية وضحاها مع 5 نانوغرام / مل CPG.

حصاد الخلايا الجذعية

DC ثقافة كاملة (الشكل 2). وسوف تكون الخلايا في كل من التعليق وانضمت إلى لوحة فضفاضة. ويمكن إزالة الخلايا الالتزام عن طريق كشط الطبق بمنديل مكشطة الثقافة والشطف مع برنامج تلفزيوني. العدد الكلي للخلايا ستزيد 5-8 مرات خلال الثقافة لمدة أسبوع وفترة التمايز ، ولذلك ، نتوقع أن الحصاد 1-1،6 × 10 6 خلية / مل.

الشكل 2

الشكل 2

الكواشف

  1. العاصمة وسائل الإعلام
    1. RPMI - 1640 وسائل الإعلام ، على أن تستكمل مع :
    2. 10 ٪ مصل بقري جنيني
    3. 100 وحدة دولية / مل من البنسلين
    4. 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين
    5. 1 ٪ L - الجلوتامين
    6. 0.1 ٪ 2 - المركابتويثانول
    7. 1X غير الأحماض الأمينية الأساسية
    8. 1X الصوديوم البيروفات
  2. الفئران المعدلة وراثيا المؤتلف - CSF
    1. rmGM - CSF (Peprotech المؤتمر الوطني العراقي ، ونيو جيرسي ، أي الكتالوج. 315-03)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البلدان النامية هي مفيدة لدراسات التفاعلات المناعية الفطرية والتكيفية ، ويمكن استخدامها كناقل اللقاح. في هذا الفيديو ، وقد برهنا على خطوات لعزل النخاع العظمي والخلايا الجذعية التفريق النخاعي في المختبر. بعد فترة الثقافة ، ويمكن تصور هذه الخلايا مجهريا كل من الخلايا الملتصقة والتي غالبا ما تمتلك التشعبات وخلايا مستديرة غير ملتصقة. ويمكن للبلدان النامية لمزيد من التلاعب العرض مستضد التي ينبض مع مستضد أو تحفيز للإنتاج خلوى وcostimulatory upregulation جزيء باستخدام السيتوكينات و / أو مستقبلات يغاندس حصيلة مثل (للمراجعة ، انظر جلبوع ، 2008 (2)).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

معتمد من قبل JB منحة دراسية من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث (NSERC). تم تقديم الدعم لهذا المشروع من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة والمنح MOP - 67066.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
recombinant murine GM-CSF Reagent Peptrotech 315-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
  2. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).

Comments

14 Comments

  1. Adherent cells are macrophages not DCs. They are >95% F4/80 positive macrophages.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2008 - 1:21 PM
  2. I confirm that!

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:12 AM
  3. The expression level of Class II molecules is strong? Have you tested the level of this marker in your cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2009 - 10:27 AM
  4. These cells are generally about ²5% MHC II+ and expression is increased >65% after stimulation (ie with LPS)

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:39 PM
  5. How long can dendritic cells be cultured for before use in an experiment? How often should media be changed if you are not using them immediately?

    Reply
    Posted by: Sarah L.
    May 5, 2009 - 3:48 PM
  6. I have never tried to culture them longer than 10 days, but they are healthy at that point. Maybe someone else has? If you do culture them longer, they should be split 1/² or 1/3 (keep the media that they're in and top up with fresh media) and more frequently if the media begins to yellow. They grow quickly at this stage!    

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:43 PM
  7. Do you know if splitting the cells will activate them? I am afraid I'll lose a lot of cells... (not sure if I should expect all of them to re-attach or not...)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 3:43 PM
  8. 14 days.

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:14 AM
  9. when i culture the cells i often see a few small (maybe 1 or ²mm) of cells. It is visible to the eye and just looks like a clump of cells under the microscope. I use GM-CSF to mature the cells but nothing to stimulate them as i have to do that as part of my experiment at a later date. I was just wondering is it normal for the cells to clump like that if they are not activated?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 5, 2009 - 9:48 AM
  10. It is normal to have these small clusters early in the culture period. They should be very rare by day 7 of culture, even after stimulation.

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    June 6, 2009 - 9:30 AM
  11. Hi, just like to ask...Should I just collect the non-adherent cells after GM-CSF differentiation for subsequent culturing if the adherent cells are macrophages?
    I intend to follow the protocol of Lutz and the whole generation of DCs will take a period of 1² days. I hope the cells can survive for a long period.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 5:30 AM
  12. why do you not use IL-4 + rmGM-CSF?, and why do you use 40 ng/mL of GM-CSF, if Luzt use ²0ng/ml? Where do you mature the DC, in the same plate?

    Reply
    Posted by: paula c.
    August 15, 2009 - 10:38 AM
  13. I work with Sprague Dawley Rats and my experience is that when I use the combination of GMCSF and IL4 the capacity of the cells to stimulate T cell activation/diferrentiation decrease.....in comparisson withthe ones culture just with GMCSF

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:10 AM
  14. When you replace/change the media...Are you lossed a lot of cells????

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:13 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics