骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

Biology

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Summary

このビデオでは、マウスの骨髄から骨髄樹状細胞を区別するための手順を示しています。マウス脛骨と大腿骨、および骨髄の処理の分離が実証されています。細胞の表現型とのCpGを用いてIL - 12産生は、次の成熟を描いた分化する前と後の細胞形態を示す写真、および数値は示されている。

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Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J. Vis. Exp. (17), e769, doi:10.3791/769 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

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Abstract

骨髄樹状細胞(DC)は頻繁に自然免疫と獲得免疫機構と感染症への早期対応との間の相互作用を研究するために使用されます。これらは、最も強力な抗原提示細胞であるため、DCがますます抗原特異的免疫応答の誘導を研究するためにワクチンのベクターとして使用されています。このビデオでは、我々はin vitroで骨髄と差別化樹状細胞を処理し、ドナーマウスから脛骨と大腿骨を採取するための手順を示しています。刺激後に樹状細胞の変化の性質:成熟DCは+ T細胞のCD4 +とCD8を持つ抗原提示と相互作用することが可能であるのに対し、未成熟樹状細胞は、強力な食細胞である。機能活性の変化は、細胞表面マーカーやサイトカイン産生のアップレギュレーションに対応しています。多数のエージェントは、サイトカインとToll様受容体リガンドを含む成熟DC、するために使用することができます。このビデオでは、我々は、CpGまたはモック治療で一晩刺激後に、二つの共刺激分子、CD86とCD40、およびサイトカイン、IL - 12の発現のフローサイトメトリーの比較を示す。分化した後、樹状細胞は、さらにワクチンのベクトルとして使用するために操作することができるまたはin vitroでのペプチドまたはタンパク質を用いてパルスする抗原特異的免疫応答を生成する、または組換えウイルスベクターを用いた形質導入。

Protocol

このプロトコルは、ルッツらから採用されています1。

骨髄の収穫と加工

  1. 脛骨と大腿骨の分離:ドナーマウスを安楽死させると70%エタノールで足をスプレー。鈍鉗子でしっかりと第一足首をつかんで、皮膚と脛骨を露出するために、基になる筋肉を切り取るために始める。骨の損傷を避けるために、膝関節はそのままに残し、脛骨にゆっくりと平行にカット。

    大腿骨をきれいにするには、鈍鉗子でつかんで膝関節を固定化する。鋭いはさみと湾曲したピンセットで筋肉組織を離れて清掃してください。股関節が露出しているとハサミが大腿骨頭と股関節の間に配置できるようになるまで上昇を続けます。リン酸塩に大腿骨と股関節と場所との間で切断して骨を削除することは氷の上に緩衝食塩水(PBS)。
  2. 骨髄の除去:はさみと曲がったピンセットを用いて骨からクリーン残りの筋組織。各骨の骨端を切断し、中央の空洞を探します。 PBSでロードされた10mLの注射器と25G0.5"針を使用して、非組織コーティングしたシャーレに骨髄をフラッシュします。
  3. 骨髄の処理:単一細胞懸濁液(動きをスクレーピングして、上下に使用する)に骨髄を解離する1mLのシリンジからプランジャーのゴムの端を使用してください。円錐形のファルコンチューブに骨髄を収集し、そしてPBSで残留骨髄をすすぐ。

樹状細胞の培養

  1. 血球計(図1)上にDCメディアとカウントDC前駆体の細胞を再懸濁します。あなたは、さまざまなサイズのセルが表示されます、DCの前駆体は、最大かつ最も明るいです。差のみこれらの細胞をカウント。 two大腿骨及び野生型のC57BL / 6マウス(6-8週齢)の二つ脛骨から、25〜40 × 10 6合計のDC前駆体との間で考えてください。



    図1

  2. 40 ng / mLの組換えマウスGM - CSFを添加したDCのメディアで2 × 10 5 DC前駆体/ mlの密度で培養細胞。非組織でコーティングされたポリスチレンのペトリ皿に細胞をプレート。

メディアを追加(3日​​目)

メディアを更新するには、40 ng / mLのGM - CSFを添加した新鮮な培地の総容積の半分を追加します。

つのメディアの第三(6日目)と成熟を交換してください

メディアを更新するには、慎重にメディアの総量の3分の1を削除し、文化の6日目で40 ng / mLのGM - CSFを添加した新鮮なDCのメディアでこのボリュームを交換してください。

必要に応じて、樹状細胞は、サイトカインやToll様受容体リガンドを用いて成熟のために刺激することができる。ビデオでは、樹状細胞を5 ng / mLののCpGで一晩刺激により成熟された。

樹状細胞の収穫

DCの文化は完了です(図2)。細胞は懸濁液中に、疎プレートに付着の両方になります。付着した細胞は、組織培養スクレーパーで皿をこすると、PBSで洗浄して除去することができます。細胞の総数は、一週間の文化と分化期間中に5〜8倍に増加する、従って、1から1.6 × 10 6細胞/ mLを収穫する予定。

図2

図2

試薬

  1. DCメディア
    1. を補充したRPMI - 1640培地、:
    2. 10%ウシ胎児血清
    3. 100 IU / mLのペニシリン
    4. 100μg/ mlのストレプトマイシン
    5. 1%L -グルタミン
    6. 0.1パーセント2 - メルカプトエタノール
    7. 1X非必須アミノ酸
    8. 1Xピルビン酸ナトリウム
  2. 組換えマウスGM - CSF
    1. rmGM - CSF(Peprotech社製株式会社、ニュージャージー州、カタログがない。315から03)

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Discussion

樹状細胞は自然免疫と獲得免疫の相互作用の研究に有用であり、ワクチンのベクトルとして用いることができる。このビデオでは、我々は、骨髄を​​分離し、in vitroで骨髄樹状細胞を区別するための手順を示している。培養期間に続いて、これらの細胞を顕微鏡の両方のような付着が多い樹状突起を持つ細胞と、非接着性円形細胞を可視化することができます。樹状細胞は、さらに抗原でパルスすることにより抗原提示のために操作したり、サイトカイン及び/またはToll様受容体リガンドを(総説については、ギルボア、2008(2)参照)を用いてサイトカイン産生と共刺激分子の発現上昇のために刺激することができる。

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Acknowledgements

JBは、自然科学と工学研究評議会(NSERC)からstudentshipsによってサポートされています。このプロジェクトのサポートは、グラントはMOP - 67066、カナダ衛生研究所によって提供されています。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
recombinant murine GM-CSF Reagent Peptrotech 315-03

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References

  1. Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
  2. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).

Comments

14 Comments

  1. Adherent cells are macrophages not DCs. They are >95% F4/80 positive macrophages.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2008 - 1:21 PM
  2. I confirm that!

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:12 AM
  3. The expression level of Class II molecules is strong? Have you tested the level of this marker in your cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2009 - 10:27 AM
  4. These cells are generally about ²5% MHC II+ and expression is increased >65% after stimulation (ie with LPS)

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:39 PM
  5. How long can dendritic cells be cultured for before use in an experiment? How often should media be changed if you are not using them immediately?

    Reply
    Posted by: Sarah L.
    May 5, 2009 - 3:48 PM
  6. I have never tried to culture them longer than 10 days, but they are healthy at that point. Maybe someone else has? If you do culture them longer, they should be split 1/² or 1/3 (keep the media that they're in and top up with fresh media) and more frequently if the media begins to yellow. They grow quickly at this stage!    

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:43 PM
  7. Do you know if splitting the cells will activate them? I am afraid I'll lose a lot of cells... (not sure if I should expect all of them to re-attach or not...)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 3:43 PM
  8. 14 days.

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:14 AM
  9. when i culture the cells i often see a few small (maybe 1 or ²mm) of cells. It is visible to the eye and just looks like a clump of cells under the microscope. I use GM-CSF to mature the cells but nothing to stimulate them as i have to do that as part of my experiment at a later date. I was just wondering is it normal for the cells to clump like that if they are not activated?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 5, 2009 - 9:48 AM
  10. It is normal to have these small clusters early in the culture period. They should be very rare by day 7 of culture, even after stimulation.

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    June 6, 2009 - 9:30 AM
  11. Hi, just like to ask...Should I just collect the non-adherent cells after GM-CSF differentiation for subsequent culturing if the adherent cells are macrophages?
    I intend to follow the protocol of Lutz and the whole generation of DCs will take a period of 1² days. I hope the cells can survive for a long period.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 5:30 AM
  12. why do you not use IL-4 + rmGM-CSF?, and why do you use 40 ng/mL of GM-CSF, if Luzt use ²0ng/ml? Where do you mature the DC, in the same plate?

    Reply
    Posted by: paula c.
    August 15, 2009 - 10:38 AM
  13. I work with Sprague Dawley Rats and my experience is that when I use the combination of GMCSF and IL4 the capacity of the cells to stimulate T cell activation/diferrentiation decrease.....in comparisson withthe ones culture just with GMCSF

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:10 AM
  14. When you replace/change the media...Are you lossed a lot of cells????

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:13 AM

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