Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Biology

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Summary

Questo video mostra la procedura per la differenziazione delle cellule dendritiche mieloidi dal midollo osseo dei topi. Isolamento di tibia e femore del mouse, e la lavorazione del midollo osseo sono dimostrati. Immagini che dimostrano morfologia cellulare prima e dopo la differenziazione, e le figure raffiguranti fenotipo delle cellule e IL-12 maturazione di produzione utilizzando i seguenti CpG sono mostrati.

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Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J. Vis. Exp. (17), e769, doi:10.3791/769 (2008).

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Abstract

Mieloide cellule dendritiche (DC) sono spesso usati per studiare le interazioni tra meccanismi immunitari innati e adattivi e la prima risposta alle infezioni. Perché questi sono l'antigene più potenti cellule presentanti l', DC sono sempre più usato come vettore vaccino per studiare l'induzione di risposta immunitaria antigene-specifica. In questo video, dimostriamo la procedura per la raccolta delle tibie e femori da un topo donatore, l'elaborazione del midollo osseo e differenziare DC in vitro. Le proprietà del cambiamento DC a seguito di stimolazione: le cellule dendritiche immature sono fagociti potenti, mentre DC mature sono capaci di presentazione dell'antigene e di interazione con CD4 + e CD8 + T. Questo cambiamento di attività funzionale corrisponde al upregulation dei marcatori di superficie delle cellule e la produzione di citochine. Molti agenti possono essere utilizzati per DC mature, tra cui citochine e Toll-like ligandi del recettore. In questo video, dimostriamo confronti citometria a flusso di espressione di due molecole co-stimolatorie, CD86 e CD40, e le citochine, IL-12, a seguito di stimolazione durante la notte con trattamento di CpG o modelli. Dopo la differenziazione, DC può essere ulteriormente manipolata per l'utilizzo come vettore vaccino o per generare una risposta immunitaria antigene-specifica in vitro utilizzando impulsi peptidi o proteine, o trasdotte con vettori virali ricombinanti.

Protocol

Questo protocollo è stato adattato da Lutz et al 1.

Raccolta ed elaborazione di midollo osseo

  1. Isolamento della tibia e femore: eutanasia il mouse donatore e spruzzare le gambe con il 70% di etanolo. Afferrare la caviglia prima saldamente con una pinza smussato e cominciare a tagliare via la pelle e la muscolatura sottostante per esporre la tibia. Per evitare di danneggiare l'osso, tagliato lentamente e in parallelo alla tibia, lasciando intatto il ginocchio.

    Per pulire il femore, immobilizzare l'articolazione del ginocchio afferrando con una pinza contundente. Pulire via la muscolatura con un paio di forbici affilate e pinze curve. Continuare verso l'alto fino a quando l'anca è esposto e forbici può essere posizionato tra la testa del femore e dell'anca. Togliere le ossa, tagliando tra comuni femore e dell'anca e del luogo in tampone fosfato (PBS) su ghiaccio.
  2. La rimozione del midollo osseo: Pulizia muscolatura residua dalle ossa con le forbici e pinze curve. Tagliare il epifisi di ogni osso e individuare la cavità centrale. Utilizzando una siringa da 10 ml caricato con PBS e un 25G0.5 "ago, a livello del midollo osseo in un non-tessuto piatto rivestito di Petri.
  3. L'elaborazione di midollo osseo: Utilizzare l'estremità in gomma dello stantuffo da una siringa da 1 ml per dissociare il midollo osseo in una cella singola sospensione (utilizzare un su e giù, non raschiando movimento). Raccogliere midollo osseo in un tubo conico falco, e risciacquare midollo osseo residuo con PBS.

Coltura di cellule dendritiche

  1. Risospendere le cellule in DC media e precursori DC contare su un emocitometro (Figura 1). Vedrete le cellule di varie dimensioni, i precursori DC sono i più grandi e più brillanti. Differenziale contano solo queste cellule. Da due femori e due tibie di una wild-type C57BL / 6 del mouse (6-8 settimane), si dovrebbe aspettare tra 25-40 x 10 6 precursori DC totale.



    Figura 1

  2. Celle di coltura ad una densità di 2 x 10 5 precursori DC / mL in DC dei media integrato con 40 ng / mL ricombinante murino GM-CSF. Cellule piastra in lastre di polistirene non tessuto rivestito di Petri.

Aggiungi media (giorno 3)

Per aggiornare i media, aggiungete la metà del volume totale di mezzi freschi integrata con 40 ng / mL GM-CSF.

Sostituire un terzo della media (giorno 6) e la maturazione

Per aggiornare i media, con attenzione rimuovere un terzo del volume totale dei media e sostituire questo volume con nuove mezzi di comunicazione integrata con DC 40 ng / mL GM-CSF al giorno 6 di cultura.

Se lo si desidera, le cellule dendritiche possono essere stimolati per la maturazione con citochine o toll-like ligandi del recettore. Nel video, DC erano maturate dalla stimolazione durante la notte con 5 ng / ml CpG.

Raccolta di cellule dendritiche

Cultura DC è completa (Figura 2). Cellule saranno sia in sospensione e liberamente aderito alla piastra. Aderito cellule possono essere rimosse raschiando il piatto con un raschietto coltura di tessuti e risciacquo con PBS. Il numero totale di cellule aumenterà 5-8 volte durante la settimana di cultura e il periodo di differenziazione, quindi, si aspettano di raccogliere 1-1,6 x 10 6 cellule / ml.

Figura 2

Figura 2

Reagenti

  1. DC dei media
    1. RPMI-1640 mezzi di comunicazione, integrato con:
    2. 10% di siero fetale bovino
    3. 100 UI / ml penicillina
    4. 100 mg / ml streptomicina
    5. 1% di L-glutammina
    6. 0,1% 2-mercaptoetanolo
    7. 1X aminoacidi non essenziali
    8. 1X sodio piruvato
  2. Ricombinante murino GM-CSF
    1. rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, nessun catalogo. 315-03)

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Discussion

DC sono utili per gli studi di interazioni immune innata e adattativa, e può essere impiegato come vettore di vaccino. In questo video, abbiamo dimostrato i passi per isolare midollo osseo e differenziare cellule dendritiche mieloidi in vitro. Dopo il periodo di coltura, queste cellule possono essere visualizzate sia le cellule al microscopio come aderenti, che spesso possiedono dendriti, e non aderente cellule rotonde. La DC può essere ulteriormente manipolata per la presentazione dell'antigene da pulsante con l'antigene o stimolate per la produzione di citochine e molecole co-stimolatorie upregulation utilizzando citochine e / o toll-like ligandi del recettore (per la revisione, vedere Gilboa, 2008 (2)).

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Acknowledgements

JB è sostenuto da borse di studio dalle scienze naturali e ingegneria Research Council (NSERC). Il supporto per questo progetto è stato fornito dal Canadian Institutes of Health Research, Grant MOP-67066.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
recombinant murine GM-CSF Reagent Peptrotech 315-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
  2. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).

Comments

14 Comments

  1. Adherent cells are macrophages not DCs. They are >95% F4/80 positive macrophages.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2008 - 1:21 PM
  2. I confirm that!

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:12 AM
  3. The expression level of Class II molecules is strong? Have you tested the level of this marker in your cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2009 - 10:27 AM
  4. These cells are generally about ²5% MHC II+ and expression is increased >65% after stimulation (ie with LPS)

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:39 PM
  5. How long can dendritic cells be cultured for before use in an experiment? How often should media be changed if you are not using them immediately?

    Reply
    Posted by: Sarah L.
    May 5, 2009 - 3:48 PM
  6. I have never tried to culture them longer than 10 days, but they are healthy at that point. Maybe someone else has? If you do culture them longer, they should be split 1/² or 1/3 (keep the media that they're in and top up with fresh media) and more frequently if the media begins to yellow. They grow quickly at this stage!    

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:43 PM
  7. Do you know if splitting the cells will activate them? I am afraid I'll lose a lot of cells... (not sure if I should expect all of them to re-attach or not...)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 3:43 PM
  8. 14 days.

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:14 AM
  9. when i culture the cells i often see a few small (maybe 1 or ²mm) of cells. It is visible to the eye and just looks like a clump of cells under the microscope. I use GM-CSF to mature the cells but nothing to stimulate them as i have to do that as part of my experiment at a later date. I was just wondering is it normal for the cells to clump like that if they are not activated?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 5, 2009 - 9:48 AM
  10. It is normal to have these small clusters early in the culture period. They should be very rare by day 7 of culture, even after stimulation.

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    June 6, 2009 - 9:30 AM
  11. Hi, just like to ask...Should I just collect the non-adherent cells after GM-CSF differentiation for subsequent culturing if the adherent cells are macrophages?
    I intend to follow the protocol of Lutz and the whole generation of DCs will take a period of 1² days. I hope the cells can survive for a long period.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 5:30 AM
  12. why do you not use IL-4 + rmGM-CSF?, and why do you use 40 ng/mL of GM-CSF, if Luzt use ²0ng/ml? Where do you mature the DC, in the same plate?

    Reply
    Posted by: paula c.
    August 15, 2009 - 10:38 AM
  13. I work with Sprague Dawley Rats and my experience is that when I use the combination of GMCSF and IL4 the capacity of the cells to stimulate T cell activation/diferrentiation decrease.....in comparisson withthe ones culture just with GMCSF

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:10 AM
  14. When you replace/change the media...Are you lossed a lot of cells????

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:13 AM

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