Kultur av myeloisk dendritiska celler från benmärg prekursorer

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Denna video demonstrerar förfarandet för att skilja myeloisk dendritiska celler från benmärg från mus. Isolering av mus skenbenet och lårbenet, och bearbetning av benmärg demonstreras. Bilder visar cellmorfologin före och efter differentiering och figurer föreställande cell fenotyp och IL-12 produktionen efter mognad med CpG visas.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J. Vis. Exp. (17), e769, doi:10.3791/769 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Myeloisk dendritiska celler (DC) används ofta för att studera samspelet mellan medfödda och adaptiva immunförsvaret mekanismer och de tidiga svar på infektion. Eftersom dessa är de mest potenta antigenpresenterande celler, är DC alltmer används som ett vaccin vektor att studera induktion av antigen-specifika immunsvar. I denna video visar vi förfarandet för skörd skenben och lårben från en donator mus, bearbetning benmärgen och differentierande utvecklingsländernas in vitro. Egenskaperna hos utvecklingsländernas förändring efter stimulering: omogna dendritiska celler är potenta fagocyter, medan mogna Utvecklingsländerna kan antigen presentation och interaktion med CD4 + och CD8 + T-celler. Denna förändring i funktionell aktivitet motsvarar det uppreglering av markörer cellytan och cytokin produktion. Många agenter kan användas för att mogna utvecklingsländerna, inklusive cytokiner och Toll-like ligander receptorn. I denna video visar vi flödescytometrisk jämförelser av uttrycket av två co-stimulerande molekyler, CD86 och CD40, och cytokin, IL-12, efter natten stimulering med CpG eller modeller behandling. Efter differentiering kan utvecklingsländernas ytterligare manipuleras för att användas som ett vaccin vektor eller för att generera antigenspecifika immunsvar genom in vitro pulserande använda peptider och proteiner, eller transduced med rekombinanta, virala vektorer.

Protocol

Detta protokoll är en anpassning av Lutz et al. 1

Skörd och bearbetning av benmärg

  1. Isolering av skenbenet och lårbenet: euthanize givaren musen och spraya benen med 70% etanol. Fatta det första vristen ordentligt med trubbig pincett och börjar skära bort huden och underliggande muskulatur att exponera skenbenet. För att undvika skador på ben, skära långsamt och parallellt med skenbenet och lämnar knäleden intakt.

    För att rengöra lårbenet, immobilisera knäleden genom att fatta tag med trubbig pincett. Rensa bort muskulaturen med ett par vassa saxar och böjda pincett. Fortsätt uppåt tills höftleden är utsatt och sax kan placeras mellan huvudet på lårbenet och höftleden. Ta bort benen genom att skära mellan lårbenet och höftleden och placera i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på is.
  2. Borttagning av benmärg: Renlighet kvarvarande muskulatur från benen med hjälp av sax och böjda pincett. Skär av epifyser av varje ben och hitta centrum hålighet. Använd en 10ml-spruta laddad med PBS och en 25G0.5 "nål, spola benmärgen till en icke-vävnad belagda petriskål.
  3. Handläggning av benmärg: Använd gummi änden av kolven från en 1 ml spruta att skilja benmärgen i en encelliga fjädring (använd ett upp och ner, inte skrapa rörelse). Samla benmärg i en konisk falk rör och skölj kvarvarande benmärg med PBS.

Kultur av dendritiska celler

  1. Resuspendera cellerna i DC-medier och räkna DC prekursorer på ett hemocytometer (Figur 1). Du kommer att se celler av varierande storlek, DC prekursorer är de största och ljusaste. Differentiellt räknas bara dessa celler. Från två lårben och två skenben av en vild-typ C57BL / 6 mus (6-8 veckor) bör du räkna med mellan 25-40 x 10 6 totalt DC prekursorer.



    Figur 1

  2. Kultur celler vid en densitet på 2 x 10 5 DC prekursorer / ml i DC media kompletteras med 40 ng / ml rekombinant murin GM-CSF. Plate celler i icke-vävnads-plåt polystyren Petri.

Lägg till media (dag 3)

Om du vill uppdatera media, lägg hälften av den totala volymen färska media kompletteras med 40 ng / mL GM-CSF.

Byt ut en tredjedel av media (dag 6) och mognad

Om du vill uppdatera media försiktigt bort en tredjedel av den totala volymen av media och ersätta denna volym med färska DC media kompletteras med 40 ng / mL GM-CSF på dag 6 av kultur.

Om så önskas kan dendritiska celler stimuleras till mognad med cytokiner eller Toll-like ligander receptorn. I videon var DC mognat genom natten stimulering med 5 ng / mL CpG.

Skörd av dendritiska celler

DC-kulturen är klar (Figur 2). Cellerna kommer att vara både i suspension och löst anslutit sig till plattan. Följas celler kan tas bort genom att skrapa skålen med en vävnadsodling skrapa och sköljning med PBS. Det totala antalet celler som kommer att öka 5-8 gånger under den veckolånga kultur och differentiering period, därför förvänta sig att skörda 1-1,6 x 10 6 celler / ml.

Figur 2

Figur 2

Reagenser

  1. DC-media
    1. RPMI-1640 medier, kompletteras med:
    2. 10% fetalt bovint serum
    3. 100 IE / ml penicillin
    4. 100 mikrogram / ml streptomycin
    5. 1% L-glutamin
    6. 0,1% 2-merkaptoetanol
    7. 1X icke-essentiella aminosyror
    8. 1X natrium pyruvat
  2. Rekombinant murina GM-CSF
    1. rmgm-CSF (Peprotech Inc, New Jersey, katalog nr. 315-03)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utvecklingsländerna är användbara för studier av medfödda och adaptiva immunförsvaret interaktioner, och kan användas som ett vaccin vektor. I den här filmen har vi visat att åtgärder för att isolera benmärg och differentiera myeloisk dendritiska celler in vitro. Efter kultur perioden, kan dessa celler kan visualiseras i mikroskop både som anhängare celler, som ofta har dendriter, och icke-häftande celler runt. DCS kan ytterligare manipuleras för antigen-presentation av pulserar med antigen eller stimuleras vid cytokin produktion och co-stimulerande molekyler uppreglering med cytokiner och / eller Toll-like ligander receptor (för översikt se Gilboa, 2008 (2)).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

JB stöds av doktorandanställning från naturvetenskap och teknik Research Council (NSERC). Stöd för detta projekt har lämnats av den kanadensiska Institutes of Health Research, Grant MOP-67.066.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
recombinant murine GM-CSF Reagent Peptrotech 315-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
  2. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).

Comments

14 Comments

  1. Adherent cells are macrophages not DCs. They are >95% F4/80 positive macrophages.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2008 - 1:21 PM
  2. I confirm that!

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:12 AM
  3. The expression level of Class II molecules is strong? Have you tested the level of this marker in your cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2009 - 10:27 AM
  4. These cells are generally about ²5% MHC II+ and expression is increased >65% after stimulation (ie with LPS)

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:39 PM
  5. How long can dendritic cells be cultured for before use in an experiment? How often should media be changed if you are not using them immediately?

    Reply
    Posted by: Sarah L.
    May 5, 2009 - 3:48 PM
  6. I have never tried to culture them longer than 10 days, but they are healthy at that point. Maybe someone else has? If you do culture them longer, they should be split 1/² or 1/3 (keep the media that they're in and top up with fresh media) and more frequently if the media begins to yellow. They grow quickly at this stage!    

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:43 PM
  7. Do you know if splitting the cells will activate them? I am afraid I'll lose a lot of cells... (not sure if I should expect all of them to re-attach or not...)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 3:43 PM
  8. 14 days.

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:14 AM
  9. when i culture the cells i often see a few small (maybe 1 or ²mm) of cells. It is visible to the eye and just looks like a clump of cells under the microscope. I use GM-CSF to mature the cells but nothing to stimulate them as i have to do that as part of my experiment at a later date. I was just wondering is it normal for the cells to clump like that if they are not activated?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 5, 2009 - 9:48 AM
  10. It is normal to have these small clusters early in the culture period. They should be very rare by day 7 of culture, even after stimulation.

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    June 6, 2009 - 9:30 AM
  11. Hi, just like to ask...Should I just collect the non-adherent cells after GM-CSF differentiation for subsequent culturing if the adherent cells are macrophages?
    I intend to follow the protocol of Lutz and the whole generation of DCs will take a period of 1² days. I hope the cells can survive for a long period.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 5:30 AM
  12. why do you not use IL-4 + rmGM-CSF?, and why do you use 40 ng/mL of GM-CSF, if Luzt use ²0ng/ml? Where do you mature the DC, in the same plate?

    Reply
    Posted by: paula c.
    August 15, 2009 - 10:38 AM
  13. I work with Sprague Dawley Rats and my experience is that when I use the combination of GMCSF and IL4 the capacity of the cells to stimulate T cell activation/diferrentiation decrease.....in comparisson withthe ones culture just with GMCSF

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:10 AM
  14. When you replace/change the media...Are you lossed a lot of cells????

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:13 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics