인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

Biology
 

Summary

ESC의 차별은 셀 타입의 특정 구조의 변화와 염색질의 구성과 일치한다. 이러한 변화의 감지는 stemcellness 및 세포 분화를 정의하는 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공합니다. 염색질 immunoprecipitation (칩)은 줄기 세포 분화를 기본 분자 메커니즘을 해부하다하는 소중한 방법을 나타냅니다.

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Bertani, S., Kan, A., Sauer, F. Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (17), e780, doi:10.3791/780 (2008).

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Abstract

metazoan 생물의 세포의 무수한의 기능 및 구조 복잡도는 줄기 세포의 소수에서 발생한다. 자기 갱신과 줄기 세포는 거의 모든 세포 1을 입력한 다음으로 차별화 수 있습니다 multipotency : 줄기 세포는 두 근본적인 속성을 특징으로하고 있습니다. 차별화된 세포에 진행의 줄기 세포가 활동을 설정하고 셀 타입 특정 유전자 발현 패턴을 유지 multipotency 구조 및 형태학의 변화와 전사 요소의 hierarchic 활동 및 신호 분자의 손실이 특징입니다. 분자 수준에서 세포 분화는 염색질의 구조와 조성의 역동적인 변화를 포함하고 이러한 역동적인 변화의 검출은 줄기 세포 및 세포 분화 과정 2,3의 기능 특징에 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 염색질은 양식 고도로 압축된 DNA - 단백질 복합 때 단백질과 세포 패키지 염색체 DNA, histones 주로 4. Stemcellness 및 세포 분화는 이러한 epigenetic 요인, 히스톤 변형, 그리고 전사 요소 2,3,5와 같은 규제 단백질의 특정 배열의 존재와 상관되었습니다.


염색질 immunoprecipitation (칩)은 RNA의 존재, 단백질 및 염색질 6,7의 단백질 수정을 모니터하는 중요한 방법을 제공합니다. 다른 세포 유형에서 염색질의 비교는 세포 차별화하는 동안 발생하는 단백질 염색질 협회의 역동적인 변화를 명료하게하다 수 있습니다.

염색질 immunoprecipitation는 생체내 교차 연결된 염색질에의 정화를 포함한다. 절연 염색질은 효소 소화 또는 기계적 강제로 작은 조각으로 줄어 듭니다. 염색질 조각은 단백질 또는 단백질과 DNA의 수정을 대상으로 특정 항체를 사용하여 시켰던 있습니다. DNA 또는 RNA 시켰던은 정화와 PCR이나 DNA microarray 기반 assays에 대한 템플릿으로 사용됩니다. 성공을위한 전제 조건 칩 원하는 항원 및 대상 분자를 표현하지 컨트롤 세포에서 염색질의 가용성에 고품질의 항체입니다. 칩은 단백질, 단백질과 RNA 수정하고, 특정 타겟 DNA와 RNA의 존재를 상관 관계, 그리고 outread 도구의 선택에 따라 특정 타겟 유전자 또는 전체 게놈의 맥락에서 대상 분자의 연결을 감지하실 수 있습니다. 차별 세포의 염색질에 단백질의 분포의 비교는 세포 혈통을 따라 세포의 진행과 일치 염색질 구성의 역동적인 변화를 명료하게하다 수 있습니다.

Protocol

해동 ES 세포 (비디오로 추천되지 않음)

ES 세포는 10 % DMSO를 포함하는 매체 냉동 있습니다. DMSO는 ES 세포의 분화를 일으킬 수 있기 때문에, 그것은 하루 늦게 세포를 해동하는 것이 가능 수 있도록 잔류 DMSO의 영향을 최소화하기 위해 다음날 아침 매체를 변경할 수 있습니다.

  1. 6 잘 조직 문화 최소한 15 분 젤라틴 0.1 %로 강판 및 판 세포에 바로 앞에 떨어져 대기음 문장.
  2. 해동 에스 37 ° C의 물을 욕조에있는 세포 (약 5 × 10 6 세포 하나의 합류 6 자에 해당)와 prewarmed ES 세포 매체의 10 ML로 희석.
  3. 벤치 - 상단 임상 원심 분리기 1000 rpm으로 10 분간 회전하여 펠렛 세포.
  4. 37 ° C prewarmed 매체 10 ML의 중간 부드럽게 resuspend 세포를 대기음.
  5. 전송 셀 6 잘 판에 서스펜션과 37 ° 성장 humidified 5% CO 2 배양기에서 C.
  6. 죽은 세포 및 잔류 DMSO를 제거하려면 다음 날 매체 변경합니다.

통로와 ES 세포 배양의 확장

ES 세포는 정기적으로 3분의 2 일마다 passaged 있으며, 매체는 대체 일에 변경됩니다. 따라서, ES 세포는 매일주의를 필요로합니다. 우리의 경험에서 피더 독립적인 ES 세포는 빠르게 성장하고 신속하게 그것이 노란색으로 변하는 매체를 시어지다. 세포 (매일 미디어를 변경하지 또는 너무 낮은 희석에서 세포를 passaging하여) 매체를 시어지다 수 있도록하는 것은 자신의 totipotency가 보장 수없는 후, 여분의 분화 및 세포 죽음을 트리거링, 세포가 위기를 받게하는 원인이됩니다. 세포가 합류에 도달하기 전에 큰 대단히 짧은 시간을 형성하고이 대단히 짧은 시간 내에 세포가 구분됩니다 아니면 죽음으로 너무 낮은 밀도, 통과하는 동안 세포의 부족 분산 또는 고르지 도금의 도금 세포는, 유사한 문제가 발생할 수 있습니다. Germline 전송은 크게들이 주입시 몸에 나타나는 경우에도, 학대되었습니다 세포 감소.

  1. 세포의 합류 6 잘 접시 매체를 기음과 세포에서 멀리 pipetting, 37 ° C prewarmed PBS로부터 2-3 ML로 씻으십시오.
  2. 1 개 중 1 개의 ML × 세포가 균일하게 작은 대단히 짧은 시간에 분산되기 전까지는 3-4분 또는 트립신 솔루션 세포를 커버.
  3. 트립신을 inactivate 중간 1 ML을 추가합니다.
  4. 갓 gelatinized 6 잘 판에 trypsinized 셀 및 플레이트 세포를 (일반적으로 잘의 2 / 5) 수집합니다.

냉동 ES 세포

  1. 위의 설명 합류 6 웰 플레이트 (약 1 × 10 7 세포) Trypsinize.
  2. 1,000 rpm으로 5 분간 중간 및 펠릿 9 ML에 trypsinized 세포를 수집합니다.
  3. 신선한 냉동 매체 1 ML의 중간 및 resuspend 세포 펠렛을 대기음. 이 cryotubes로 나누어지는 세포의 0.5 ML합니다.
  4. -80에서 튜브를 고정 ° C 야간 및 장기 저장을 위해 액체 질소로 전송할 수 있습니다.

칩 - 온 - 칩 절차

Immunoprecipitation

  1. 포름 알데히드 crosslinking 세포 (현탁액 세포에 대한)
    1. 각 immunoprecipitation 1 X 10 8 세포 - 5 X 10 7을 사용합니다.
    2. 1 % 농도에서 세포 현탁액에 신선한 포름 알데히드를 추가합니다.
    3. 실온에서 10 분 동안 포름 알데히드 솔루션 세포 Incubates.
    4. 포름 알데히드를 끄지하기 위해 1.25 M 글리신의 10분의 1 볼륨을 추가합니다.
    5. 1X PBS 10 ML과 두 세포 린스.
    6. 풀 50 ML 원뿔 튜브에 세포를 4에서 5 분 700g에 스핀 ° C. 용해 완충액 1.5 ML에 뜨는 및 resuspend 펠렛 폐기하십시오. 1.5 ML의 microfuge 튜브에 세포를 전송합니다.
  2. 플래시 동결 세 번 액체 질소에서 세포 및 세포를 휴식하는 조직 연삭기를 사용합니다. 일단 세포가 가교 있으며, 그들은 ° C 무기한 -80에서 냉동 보관 수 있습니다.

(단계는 모든 ° C 4 수행됩니다) 자기 구슬을 준비

  1. 1.5 ML 낮은 유지 microtube에 Dynal 구슬 50 μl를 추가합니다. immunoprecipitation마다 구슬 1 튜브를 설정합니다. 1 ML 블록 솔루션을 추가합니다.
  2. Dynal MPC를 사용하여 구슬를 수집합니다. 자기 랙에 플레이스 튜브. 구슬은 튜브의 측면에서 수집하도록 허용합니다. 이것은 약 15 S.을 취하 구슬을 수집하는 데 도움이 두 번 랙 반전. pipettor와 함께 뜨는 제거합니다.
  3. 아직 장소에 튜브, 랙 및 반전 랙에서 자기 스트립을 제거 1 ML 블록 솔루션 및 부드럽게 resuspend 구슬을 추가 - 비즈가 고르게 resuspend 아르 평균의 10 배에서 20 배를하거나, 또는 때까지. (2 단계) 위와 같이 구슬를 수집합니다. pipettor와 함께 뜨는 제거합니다.
  4. 3 단계, 한 번만 더 같이, 1.5 ML 블록 솔루션 비즈 씻으십시오.
  5. 750 μl 차단 솔루션의 구슬을 Resuspend 및 항체의 10 μg를 추가합니다. 회전, 또는 야간, 6h 최소 4 ° C에서 알을 품다.
  6. 구슬 세 t를 와시1 ML 블록 솔루션 임즈은 3 단계에서 설명한대로.

셀 sonication

  1. sonication을위한 튜브에 ° C 및 전송 세포 -80에서 냉동 세포 알약을 제거합니다. 현재 sonication에 대한 표준 polupropylene의 하단 15 ML 원뿔 튜브를 사용하는 것을 선호합니다. 우리는 5 ML 마르크에 두 가지의 튜브를 잘라 상반신을 삭제. 설정하는 동안 튜브는 parafilm 또는 튜브 캡으로 덮여 수 있습니다.
  2. sonicator 프로브는 튜브의 바닥 위에 약 0.5-1.0 cm에 앉아 있도록 microfuge 튜브 랙, 위치 튜브를 사용하여. 프로브가 중심이며, 튜브의 측면 연락을하지 않는 몸조심. (프로브 위치는 솔루션 foams 여부 sonication 동안 영향을 줄 수 있습니다. 일반적으로 거품이 sonicated DNA가 제대로 가지각색 수 없음을 나타냅니다.)
  3. 20 S. 동안 정지 6 번 Sonicate 샘플은 sonication 동안 얼음 물을 욕조에 보관해야합니다. 처음에 0으로 출력을 설정 거품 감소하고 첫번째 버스트 동안 최종 전원을 수동으로 증가합니다. (거품 상당한있다면, 모든 거품이 더 거품 방울을 떠나고, 모든 자료의 부드러운 resuspension 다음 20,000그램에서 원심 분리하여 제거할 수 있습니다.)
  4. 4 10 분 2만g에 스핀 ° C 펠렛의 파편과 1.5 ML 튜브에 수확 뜨는 있습니다.
  5. 입력 DNA 각 샘플에서 세포 lysate 50 μl를 저장합니다. -20 ° C.에 저장 적어도 하나의 입력의 DNA 나누어지는는 sonicate lysate의 배치 당 보관해야합니다. sonication과 조각 크기의 발생 분포의 영향의 효과에만 crosslink 반전과 DNA의 정화 후 확인하실 수 있습니다.

염색질 immunoprecipitation

  1. 셀 sonication에서 1 X 10 8 셀, 1 ML의 최종 볼륨 (그것은 수와 자기 구슬, 6 단계 준비에서 50 μl 항체 / 자석 구슬 섞어 단계 4-5 X 10 7의 염색질 - 상응하는 금액을 추가 용해 완충액, 어느 경우)와 조정이 가능. 4 회전에서 밤새 품어 ° C.

빨래

  1. Dynal MPC를 사용하여 구슬를 수집합니다. 랙에 플레이스 튜브. 구슬은 튜브의 측면에서 수집하도록 허용합니다. 이것은 약 20 S.을해야합니다 모든 구슬을 수집 도움이 두 번 랙 반전. 샘플 사이의 도움말을 변경 pipettor와 함께 뜨는 제거합니다.
  2. 1 ML의 용해 각각의 튜브에 버퍼와 부드럽게 resuspend 구슬을 추가합니다. 10-20 번 또는 비즈가 고르게 resuspended 때까지 -이 아직도 자리에 튜브, 랙 및 반전 랙에서 자기 스트립을 제거하여 수행할 수 있습니다. 구슬를 수집합니다. pipettor로 뜨는을 제거합니다. 세척 사이의 도움말을 변경,이 세차, 5 번 이상 반복합니다.
  3. 이 단계는 2 단계에 설명된대로 한 ML IP1 버퍼에 구슬 6 번 씻으십시오.
  4. 이 단계는 2 단계에 설명된대로 1, ML IP2 버퍼의 구슬 6 번 씻으십시오.
  5. 이 단계는 2 단계에 설명된대로 한 ML TE 8.0 버퍼에 구슬 6 번 씻으십시오.
  6. 4 3 분 960g에 스핀 ° C 및 잔여 TE 버퍼를 제거합니다.

용리

  1. 15 분 65 ° C의 물을 욕조에서 튜브를 잠복기로 비즈에서 용출 버퍼와 elute 소재의 210 μl를 추가합니다. 간략 소용돌이 매 2 분. 이 부화는 eluate의 회복을 향상시킬 수 있습니다 30 분,만큼 확장할 수 있습니다.
  2. 상온에서 1 분 1만6천g에 구슬을 봐.
  3. 뜨는 200 μl를 제거하고 새 튜브로 전송할 수 있습니다. 재료는 -20 ° C에서 냉동 및 야간 저장할 수 있습니다.

Crosslink 반전

  1. 6 H 15 H (crosslink 반전의 긴 시간이 보통 microarray 분석의 증가 소음 발생)의 최대 최소 65 ° C에서 잠복기에 의해 용출, 3 단계에서 immunoprecipitation DNA를 crosslink 역방향. 튜브가 균일하게 가열하고 형성 이하 결로가되도록이 부화는 오븐에 할 수 있습니다.
  2. sonication 후 예약된 입력 DNA (단계 13) 50 μl를 해동, 용출 버퍼와 혼합 150 μl (3 권) 추가합니다. ° C Crosslink 반전, 1 단계에서와 같이 65 잠복기하여 입력 DNA를 crosslink 역방향. 이 시점에서, immunoprecipitation 또는 입력 DNA의 모든 튜브는 이후 단계를 처리하는 별도의 튜브 또는 샘플로 간주됩니다.

정화 DNA

  1. 10 MG ML - 1 RNaseA (0.2 MG ML - 1 최종 농도) 8 μl, 반전 튜브를 여러 번하여 믹스를 추가 2 H. 위해 37 ° C를 품어
  2. 20 MG ML - 1 Proteinase K (0.2 μg ML - 1 최종 농도)과에 대한 반전 튜브 55 여러 시대와 부화는 ° C의 혼합이 H. 4 μl 추가
  3. 클로로포름 : : 400 μl 페놀 추가 isoamyl 알콜 (P : C : IA), 와동 2 ML 중공업 Phaselock 튜브 (Eppendorf에서 제공하는 지침을 따르십시오)와 별도의 단계를.
  4. P 경우 : C : IA 솔루션은 나이 또는 낮은 산도에서이며, degr있을 것입니다유효한 타겟의 검출의 microarray 분석 및 손실에 소음을 일으키는 DNA의 adation.
  5. 5M NaCl (200 ㎜) 최종 농도) 16 μl와 1.5 20 μ의 μl μl - 1 글리코겐 (30 μg의 총.)를 포함하는 새로운 원심 튜브에 수성 층을 전송
  6. 800 μl EtOH를 추가합니다. -80에서 -20 ° C 또는 30 분 ° C.에서 하룻밤을 위해 알을 품다
  7. 4 10 분 2만그램에 스핀 ° C를 펠렛 DNA 있습니다. , 80 % EtOH 500 μl를 추가 resuspend 펠렛을 vortexing 4에서 5 분 20,000그램에서 다시 회전 ° C.하여 알약을 와시
  8. 남아있는 80 % EtOH를 제거합니다. 남아있는 액체를 수집하고 펠렛을 피하기 위해, pipetteman와 액체 제거 간단히 튜브를 스핀. 알약은 마른 때까지 튜브 공기가 건조 보자 : 알약은 아직 촉촉한 모습을 유지한다. 10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0 70 μl의 각 펠렛을 Resuspend.
  9. 이 알약의 Overdrying 것은 그들이 resuspend 어렵거나 멀리 튜브의 측면에서 매우 특이한 개성과 껍질 책임을 만들 수 있습니다.
  10. 옵션 : 나중에 사용하기 위해 immunoprecipitation 샘플 15 μl를 저장합니다. 이 자료는 microarray 결과의 유전자 특정 PCR 확인을 수행하는 데 사용하실 수 있습니다.
  11. UV 흡수 (260 NM)의 농도를 정량.

NB : 도서관 준비와 증폭 dNTPs없이 시그마에서 10X 앰프 믹스와 수정 GenomePLex WGA 키트를 사용을 포함하여 다음 단계 :

도서관 준비

시그마에서 10X 앰프 믹스와 GenomePLex WGA 키트에서 사용 가능

  1. 정화 DNA, PCR 튜브에 11 단계에서 DNA 샘플의 10 μl로 1X 도서관 준비 버퍼 2 μl를 추가합니다.
  2. 도서관 안정화 솔루션 1 μl를 추가합니다.
  3. 와동 철저하게, 원심 분리에 의해 통합, 및 95에서 열 자전거 타는 사람에서 개최 ° C 2 분.
  4. 얼음 샘플을 쿨, 원심 분리하여 원심 분리에 의해 통합, 그리고 얼음으로 돌아갑니다.
  5. 한 도서관 준비 효소 μl, 철저하게 소용돌이 후 간단히 원심 분리기를 추가합니다.
  6. 로 열 자전거 타는 사람과 부화에 넣어 샘플은 다음과 :
    • 20 분 동안 16 ° C
    • 20 분 동안 24 ° C
    • 20 분 동안 37 ° C
    • 5 분 75 ° C
    • 4 ° C 개최
  7. 열 자전거 타는 사람 및 원심 분리기의 간략에서 샘플을 제거합니다. 샘플은 20 ° C 사흘 동안 즉시 증폭하거나 저장할 수 있습니다.

확대

시그마에서 10X 앰프 믹스와 GenomePLex WGA 키트에서 사용 가능

  1. 마스터 믹스는 아래 3 단계에서 15 μl 반응에 다음 시약을 추가하여 준비 :
    • 10X 앰프 믹스 7.5 μl (dNTPs 제외)
    • WGA의 DNA 중합 효소의 5.0 μl
    • 10 MM dNTP (각) 주식 (최종 농도 0.4 ㎜)의 3.0 μl
    • nuclease 무료 물로 75 μl로 최종 반응 부피를 가지고
  2. 철저히 와동. 짧게 원심 분리기 및 thermocycling을 시작합니다.
    • 3 분 초기 변성 95 ° C
    • 다음과 같은 14 사이클을 수행합니다 :
    • 15 초 동안 변성 94 ° C
    • 65 연장 / 어닐링 ° C를 5 분
    자전거가 완료되면, 4 반응을 유지 분석 또는 정화 준비까지 ° C 또는 -20 ° C에 저장합니다.
  3. 제조 업체의 지시에 따라 Quiagen에서 PCR의 정제와 함께 DNA ® 키트를 정화하고 UV 흡수 (260 NM)의 농도를 정량.
  4. 다시 도서관 준비에서 증폭의 사이클을 수행 다음 adaptations와 증폭, 2 단계로 1 단계.

    • 조각 과정을 시작하려면 위의 3 단계에서 필요한 DNA의 양을에 대하여 : DNA의 농도는 μg / ML, 샘플 2.5 μl를 사용하여 10 μl의 최종 볼륨에 물을 조정 200-300 주위에있다면.
    DNA의 농도가 50-60 μg / ML 주위에있다면, 샘플 5 μl를 사용하여 10 μl의 최종 볼륨에 물을 조정합니다.


    •이 두 번째 증폭 과정에서 마스터 믹스에 대한 dTTPs와 dNTPs 10 MM dATP, 10 MM dGTP, 10 MM dCTP 8 MM dTTP 같은 농도 그 이전 믹스 2 당연 dUTP를 포함한 혼​​합에 대한 대가이다.

  5. UV - 마주 분광 광도계를 사용하여 측정 DNA (260 NM). 일반적으로 증폭된 DNA의 이상 9 μg는 각 반응에서 얻은 것입니다.

    NB : DNA 대상의 라벨이 GeneChip과 수행 ® Affymetrix에서 WT 두 번 좌초 DNA 터미널 Labelling Kit를 제조 업체의 지시에 따라, 아래에 설명된대로 :

조각 증폭 대상

  1. 대상을 입력합니다 어떤 배열에 따라 아래의 해당 테이블을 사용하여 샘​​플을 조각 하이브리드 것입니다에 ized.

    표 1. 하나의 배열에 대한 조각화 믹스
    1 Rxn의 구성 요소 볼륨 / 금액
    두 번 좌초 DNA 7.5 μg
    10X cDNA 파쇄 4.8 μl
    UDG, 10 U / μl 1.5 μl
    원숭이 1, 100 U / μl 2.25 μl
    최대 48 μl로 Nuclease없는 물
    Affymetrix GeneChip ®에서 WT 두 번 좌초 DNA 터미널 Labelling Kit에서 사용 가능

    표 2. 다중 배열 집합에 대한 조각화 믹스
    1 Rxn의 구성 요소 볼륨 / 금액
    두 번 좌초 DNA 9 μg
    10X cDNA 파쇄 4.8 μl
    UDG, 10 U / μl 1.5 μl
    원숭이 1, 100 U / μl 2.25 μl
    최대 48 Nuclease없는 물
    Affymetrix GeneChip ®에서 WT 두 번 좌초 DNA 터미널 Labelling Kit에서 사용 가능
  2. 위의 두 테이블에 따라 조각 믹스를 설정합니다. 플릭 - 믹스와 튜브를 스핀 다운.
  3. 에서 반응을 품어 :
    • 1 H.위한 37 ° C
    • 2 분 93 ° C.
    • 최소한 2 분 동안 4 ° C.
  4. 플릭 - 믹스, 튜브를 스핀 다운하고 새 튜브에 시료 45 μl를 전송합니다.
  5. 젤 교대 분석을 위해 각 샘플 2 μl를 제거합니다.

라벨 조각을 두 번 좌초 DNA

  1. 아래 테이블에 설명된 두 번 좌초의 DNA Labelling 믹스를 준비 :

    표 3. 더블 좌초의 DNA Labelling 믹스의 구성
    1 Rxn의 구성 요소 볼륨 / 금액
    배 가열 치사 버퍼 12 μl
    가열 치사 시간이 μl
    DNA의 Labelling 시약, 5 MM 1 μl
    총 부피 15 μl
    Affymetrix GeneChip ®에서 WT 두 번 좌초 DNA 터미널 Labelling Kit에서 사용 가능
  2. DNA 샘플, 영화 - 믹스에 두 번 좌초 DNA 라벨 믹스 15 μl를 추가하고 그들을 스핀.
  3. 에서 반응을 품어 :
    • 37 ° C 60 분.
    • 10 분 70 ° C.
    • 4 ° C 최소한 2 분.
  4. 젤 교대 분석을 위해 각 샘플 2 μl를 제거합니다.

젤 교대 분석

  1. 4% 아가로 오스 겔을 준비합니다.
  2. 조각 증폭 대상으로, 5 단계와 라벨 조각을 두 번 좌초 DNA, 65 단계 4 명이 2 분 C에서 샘플을 품어.
  3. 10 Streptavidin (1 MG / ML)의 μl, 5 분 실온에서 품어 샘플을 추가합니다.
  4. 상표 제품의 변화 마이 그 레이션을 확인 4% 아가로 오스 겔에서 3 단계 (젤 교대 분석, 1 단계)에서 샘플을 실행합니다.

세척 배열 하이브 리다이 제이션 및 배열

캘리포니아 리버 사이드 대학의 게놈 센터에 의해 수행.

배열 분석

전산 분석에 의해 수행.

버퍼 조성 :

차단 해결 방법 : PBS + 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA).

용해 완충액 : 50 MM HEPES - 코, 산도 7.5
140 MM NaCl
1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)
1 % 트리톤 X - 100
0.1 % SDS
1mM PMSF
최종 산도 7.5

IP1 : 용해 버퍼 + 500 MM NaCl

IP2 : 10 MM 트리스 - HCL
250 MM LiCl
1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)
0.5 % NP - 40
0.5 % 나트륨 Dioxycholat
최종 산도 8.0

TE : 10 MM 트리스, 산도 7.4
1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)

최종 산도 8.0
용출 버퍼 : TE 버퍼 + 1% SDS.

Discussion

염색질 immunoprecipitation (칩)은 세포 분화 동안 염색질 기반 프로세스의 해부에 대한 귀중한 기술을 제공합니다. 이 방법의 성공을위한 전제 조건은 좋은 항체와 관심의 항원이 부족 제어 세포 또는 조직에서 염색질의 가용성입니다. DNA microarray 기술, 정보의 방대한와 칩을 결합하여 얻을 수 있습니다. 칩 결과의 검증은 세포 개발하는 동안 생물 학적 프로세스의 실행과 동적 단백질 협회, 단백질 수정 및 / 또는 RNA를 연결할 수있는 적합한 테스트 시스템의 가용성에 따라 달라집니다.

Acknowledgements

제출 작품은 FS하는 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM)에서 부여 (RS1 - 00477-1)에 의해 지원됩니다

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Poteinase-K Reagent Roche Group #EO0491
RNase-A Reagent Fermentas #EN0531
formaldehyde 37% Reagent EMD Millipore FX040-13
Chloroform Reagent EMD Millipore 3150
Ethanol Reagent Goldshield
phenol:chloroform:isoamyl alcohol Reagent Invitrogen 15593-031
SA, fraction V Reagent EMD Millipore 2930
Dubecco’s Phosphate Buffered Saline Reagent GIBCO, by Life Technologies 14190
HEPES Reagent EMD Millipore 5330
Sodium Chloride Reagent Fisher Scientific S271-10
EDTA Reagent EMD Millipore 4050
Triton X-100 Reagent EMD Millipore 9410
Sodium Dodecyl Sulfate Reagent JT Baker 4095-02
Lithium chloride Reagent EMD Millipore 5910
Tris-HCl Reagent EMD Millipore 9230
NP-40 Reagent Calbiochem 492015
Deoxycholic acid, sodium salt Reagent Fisher Scientific BP349-100
Ammonium acetate Reagent Applichem 631-61-8
Glycine Reagent EMD Millipore 4840
Glycine Reagent EMD Millipore 4840
dynalbeads, protein A Reagent Invitrogen 100.02D
dynalbeads, protein G Reagent Invitrogen 100.04D
1.5ml Low Retention Microtubes, Xtreme Other Phenix Research Products MAX-815S
Phase Lock Gel Light, 2.0 ml Reagent Eppendorf 955154037

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comments

5 Comments

  1. how to prepare ChIp-DNA sample for sequencing?( single-End; solexa)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 30, 2008 - 9:17 AM
  2. Hi
    Thanks for the protocol. Do you have any protocol for less than 10,000 cells?
    Ramji

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 8, 2008 - 7:27 PM
  3. hi, search in Nature protocols as microChIP. This protocol was made for up to minimun of 100 cells or more. This is great protocol best wishes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 21, 2009 - 8:56 PM
  4. what is a good positive control antibody to show that the procedure works?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 18, 2010 - 3:47 PM
  5. It is a very general question, but you can use histone antibodies as positive controls.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 18, 2010 - 5:01 PM

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