عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم في وقت مبكر من الكيس المحي الفئران وAGM

Published 6/27/2008
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

هذا الفيديو يوضح كيفية الجزئي تشريح كيس المح والشريان الأورطي ، الغدد التناسلية ، mesonephros المنطقة من الأجنة واستخدام التدفق الخلوي لفرز الخلايا الجذعية المكونة للدم.

Cite this Article

Copy Citation

Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM. J. Vis. Exp. (16), e789, doi:10.3791/789 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

في جنين الفأر ، في وقت مبكر تكون الدم يحدث في وقت واحد في الهيئات المتعددة ، التي تشمل كيس المح والمنطقة التناسلية ، الشريان الأورطي ، mesonephros. هذه المناطق تشكل عاملا حاسما في إنشاء نظام الدم في الأجنة ويؤدي في نهاية المطاف لحركة الخلايا الجذعية الجنينية في الكبد ومن ثم تطوير خلايا جذعية للبالغين في bonemarrow. يمكن عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم في وقت مبكر من هذه الأجهزة من خلال microdissection الجنين تليها فرز cytometric تدفق السكان من الحصول على أكثر نقاء. يبقى من غير الواضح كيف يمكن لهذه الخلايا الجذعية تسهم السكان إلى تجمع الخلايا الجذعية الجنينية والكبار. أيضا ، تحقق في مختبرنا كيف تختلف الخلايا الجذعية في وقت مبكر وظيفيا من الخلايا الجنينية والبالغين الجذعية المكونة للدم. علاوة على ذلك ، يفرز مختبرنا مجموعات مختلفة من الخلايا الجذعية المكونة للدم واختبار دورها الوظيفي في سياق مجموعة متنوعة من النماذج الوراثية. في هذا الفيديو ، ونحن لشرح تشريح الداخلي الدقيقة التي نستخدمها عادة ، وتظهر أيضا نتائج plotfter FACS نموذجية عزل هؤلاء السكان نادرة ، فمن الممكن لتنفيذ مجموعة متنوعة من المقايسات الفنية بما في ذلك : المقايسات مستعمرة وزرع نخاع العظام.

Protocol

تشريح والعزلة في وقت مبكر من الخلايا الجذعية المكونة للدم من الكيس المحي الفئران والشريان الأورطي ، الغدد التناسلية ، mesonephros المنطقة

  1. قبل أن تبدأ ، فمن المهم أن يكون كل الكواشف والأدوات اللازمة لإجراء العملية :
    • مقص
    • ملقط ، حجم 4 ، والجراحية الصف عازمة ذات الرؤوس ملقط ، حجم 5 / 45 (اختياري)
    • إبر عيار 30 مع حقنة
    • أطباق بتري 35mm و 100mm
    • برنامج تلفزيوني مع 10 ٪ و 20 ٪ مصل بقري جنيني
    • وأخيرا ، كولاجيناز
  2. للبدء في التشريح ، ونحن بحاجة لحصاد القرون الرحم من النساء الحوامل بنسبة 10.5 مفهوم آخر أيام.
  3. يصرح باستخدامها في الحيوانات وفقا للاجراءات المعتمدة. نستخدم ثاني أكسيد الكربون الاختناق ، تليها خلع عنق الرحم.
  4. بطن الأنثى هو الرطب مع الإيثانول وفتح الجلد مع المقص.
  5. القابضة للجلد مع ملقط ، يتم إجراء تخفيضات إضافية لفتح البريتوني.
  6. يتم فتح البطن والرحم القرون يمكن تصور. باستخدام الملقط لعقد قرون الرحم ، وقطع كل نهاية القاصي ومركز لاستئصال كل من قرنيه.
  7. ثم توضع في الرحم قرون طبق بيتري الباردة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني مع FBS 10 ٪ لإزالة أنسجة الرحم.
  8. باستخدام حجم 4 ملقط والتي تعمل تحت المجهر ، وإزالة أنسجة بطانة الرحم بلطف حول كل من الحمل المستكن الجنين ، والحرص على عدم ثقب المشيمة.
  9. إزالة مرة واحدة ، وتوضع الأجنة في طبق برنامج تلفزيوني جديد مع البرد وFBS 10 ٪.
  10. إزالة أنسجة المشيمة بعناية للكشف عن الجنين المغطى في كيس المح باستخدام ملقط الجنين لخفض المغطى الكيس المحي بعيدا عن المشيمة في المرحلة الخاصة بهم. الكيس المحي الشرايين تحتوي على صفار ، وجزء من الحبل السري ، يمكن مثار بلطف بعيدا من الجنين ويترك جانبا لتفارق على الجليد.
  11. يتم نقل الجنين الى طبق بيتري صغيرة مع مستويات أدنى من برنامج تلفزيوني مع FBS 10 ٪ -- ما يكفي لالرطب الجنين ولكن ليس كثيرا. المستويات المثلى حفاظ على الجنين ثابتة بينما يتم تحريكها ببطء لوحة ، والحفاظ على الجنين في مكان آمن أثناء تشريح.
  12. التبديل إلى إبر عيار 30 ، والتي تستخدم لإزالة الأجزاء العلوية والسفلية من الجنين عن طريق خفض الأمامية فوق وتحت hindlimbs. قد أصبح معتادا على استخدام الإبر وأدوات القطع يستغرق بعض الممارسة. وهناك طريقة استخدام قطع صغيرة متكررة من عبور الإبر تشريح الأنسجة ، مع الإبرة التي عقدت في اليد المهيمنة ليكون بمثابة دليل لقطع الإبرة التي عقدت في يد غير المهيمنة.
  13. إزالة الجزء الظهري للجنين. هذه هي الأنسجة التي تحتوي على somites. خفض بلطف بعيدا النسيج الظهري بينما معظم الباقين على مسافة كافية من الشريان الأبهر (خط أحمر) لمنع أي نيكس. وقطع الشريان الأورطي يؤدي إلى فقدان الدم وعدم القدرة على تصور بسهولة موقعه. مرة أخرى ، مما يجعل الجروح الصغيرة مع الإبر أمر حيوي للحفاظ على موقع قطع دقيقة.
  14. دفع الأنسجة خارج بعيدا عن الأنظار وتحويل الجنين في جميع أنحاء لقطع الأنسجة بطني ، وقطع مرة أخرى أقرب إلى الشريان الأورطي ممكن من دون knicking عليه. جعل التخفيضات بعيدا جدا عن مكان أفضل من شأنه أن يؤدي في أنسجة البطن يجري اليوم ، والتي يمكن إزالتها بمجرد أن يتم عزل الجمعية العمومية.
  15. موقف الجنين مع الجانب الظهري أسفل ظهرها أو على طبق من ذهب. وسع بلطف الجنين فتح طريق دفع الجانبين إلى أسفل وتصور مكان التلال الغدد التناسلية. وتقع هذه قليلا خارج المركز كما أنبوب يشبه الهياكل على جانبي الشريان الأورطي.
  16. تشريح كاملة عن طريق إزالة الأنسجة الزائدة الجانب باستخدام تقنيات خفض نفسه كما كان من قبل. بمجرد إزالة الأنسجة الجانب من الجنين ، ثم تحول الجنين رأسا على عقب لإزالة الأنسجة الجانب المتبقية.
  17. عند هذه النقطة ، ويتم تفتيش الجمعية العمومية للأي نوع من الأنسجة الزائدة التي يمكن إزالتها بسهولة مع الإبر دون وقوع إصابات في الشريان الأورطي أو الغدد التناسلية. إزالة الزائدة كما قدر النتائج الممكنة في أفضل عزل الخلايا الجذعية السكان نظرا لأننا نعتمد على مجرد علامات سطح الخلية قليلة للتنقية.
  18. باستخدام الملقط عازمة ذات الرؤوس ، مغرفة برفق ومكان كل اجتماع الجمعية العامة العادية في برنامج تلفزيوني الباردة مع FBS 10 ٪ حتى جاهزة للتفكك.

تفارق وتحليل FACS

  1. أن يفرق بين الأنسجة ، وصفار المقام الأول وبيانات توزيع الأكياس في أنابيب منفصلة.
  2. تدور لفترة وجيزة إلى الأنسجة وتجاهل بيليه في برنامج تلفزيوني مع FBS 10 ٪.
  3. Resuspend الأنسجة في كولاجيناز 0.25 ٪ في برنامج تلفزيوني مع FBS 20 ٪ ، حيث وصل حجم ما يكفي لتغطية كافية الأنسجة.
  4. احتضان الأنسجة عند 37 درجة. 25 - 30mins لبيانات توزيع 40mins و 35 مقابل كيس المح.
  5. في نهاية الحضانة ، ماصة الأنسجة بلطف صعودا ونزولا إلى التفكك في تعليق خلية واحدة.
  6. غسل المناديل مع واي PBS الزائدةال 10 ٪ FBS ، بيليه الخلايا وresuspend في برنامج تلفزيوني العقيمة جديدة مع FBS 10 ٪.
  7. تحليل لنظام مراقبة الأصول الميدانية ، هي الخلايا الملون وفقا لتوصيات الشركة الصانعة. نستخدم FACSAria من العلوم البيولوجية دينار بحريني لأداء التدفق الخلوي. نظرا لحجم والهشاشة من الخلايا الجنينية ، يتم ضبط فتحة الفرز لأكبر قطر للخلايا المكونة للدم من الكبار ، ونحن أيضا دراسة في المختبر. وبالمثل ، يتم ضبط الضغط إلى أن تكون أقل من الشروط المطلوبة من قبل الخلايا المكونة للدم البالغين. على سبيل المثال ، والفرز على FACSAria ، فإن حجم فوهة تكون 100 ميكرون والضغط سيكون فرز 30 رطل.
  8. يتم عزل الخلايا الجذعية لتحاليل ، يتم عزل الخلايا إيجابية الثلاثي معربا عن cKit علامات ، CD34 ، CD41 ووفرزها من الكيس المحي وايجابيات مزدوجة (cKit ، CD34) من الجمعية العمومية عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية. ومن شأن المؤامرة نموذجي تبدو هذه : ويتم تحليل الخلايا إيجابية لcKit CD34 CD41 وبشكل متزامن أو بشكل فردي. وعادة ما تعرض الخلايا لتدرج من الإيجابية لكل علامة مع الخلية الجذعية السكان كما وجدت مجموعة فرعية من السكان إيجابية. هذه المؤامرات تبين لنا أننا قد حققت غلة جيدة مع 100-300 خلية خلية لكل كيس المح ومساعد المدير العام الواحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats