小鼠卵黄囊和AGM早期造血干细胞的分离

Biology

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Summary

该视频显示如何微观剖析,从胚胎的卵黄囊和主动脉 - 性腺 - 中肾区,使用流式细胞仪检测造血干细胞进行排序。

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Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM. J. Vis. Exp. (16), e789, doi:10.3791/789 (2008).

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Abstract

在小鼠胚胎早期造血同时发生在多个器官,其中包括卵黄囊和主动脉 - 性腺 - 中肾区。这些地区都建立在胚胎的血液系统是至关重要的,并导致最终运动的干细胞进入胎儿的肝脏,然后在bonemarrow成人干细胞的发展。早期的造血干细胞可以从这些器官通过流式细胞仪排序其次,以获得更纯净的人口胚胎显微切割分离。目前还不清楚如何将这些干细胞群,促进胎儿和成人的干细胞池。此外,我们的实验室研究如何早期干细胞从胎儿和成人的造血干细胞功能不同。此外,我们的造血干细胞实验室的各种不同的人群和在各种遗传模型中测试其职能作用。在这个视频中,我们表现出的微观解剖过程中,我们经常使用,也显示了一个典型的流式细胞仪,隔离这些稀有人群plotfter结果,它是可以执行各种功能检测,包括:殖民地检测和骨髓移植。

Protocol

早期造血干细胞从小鼠卵黄囊和主动脉 - 性腺 - 中肾区的解剖和隔离

  1. 在开始之前,所有的试剂和程序所需的工具是很重要的:
    • 剪刀
    • 镊子,大小为4,手术级弯嘴钳,大小为5 / 45(可选)
    • 30表针,用注射器
    • 35毫米和​​100mm的培养皿
    • PBS与10%和20%胎牛血清
    • 最后,胶原酶
  2. 要开始解剖,我们需要收获怀孕的女性从10.5天后受孕的子宫角。
  3. 动物安乐死按照批准的程序。我们用二氧化碳窒息,颈椎错位。
  4. 女性的腹部是用无水乙醇湿润的皮肤是用剪刀打开。
  5. 与皮肤钳,额外的削减打开腹膜。
  6. 打开腹部和子宫角可以可视化。使用镊子举行的子宫角,切每个末端和消费两个角的中心。
  7. 子宫角,然后放置在培​​养皿含10%胎牛血清的冷PBS去除子宫组织的菜。
  8. 使用大小为4钳和显微镜下工作,轻轻取出子宫内膜组织,从每个胚胎conceptus周围,小心不要胎盘穿刺。
  9. 一旦取消,胚胎被放置在一个用冷PBS和10%胎牛血清的新鲜菜。
  10. 小心地取出胎盘组织中揭示胚胎卵黄囊包裹使用镊子削减包裹胚胎的卵黄囊胎盘他们时刻远离。卵黄囊含有卵黄动脉和脐带的一部分,可以轻轻地戏弄远离胚胎,并设置为解离冰作废。
  11. 胚胎是搬到一个小培养皿中含10%胎牛血清的PBS的最低水平 - 刚好够湿的胚胎,但没有太多。最佳水平保持胚胎平稳,而该板块慢慢激动,稳固地保持在胚胎期间清扫。
  12. 切换到30表针,这是用来消除以上的前肢和后肢低于切割胚胎的上部和下部。熟悉用切割工具的针头可能会采取一些做法。一个小切口跨越针反复使用的方法将解剖组织,作为一个针,在非优势手举行的切割指导中的主导举行的针。
  13. 取出胚胎的背侧部分。这是包含体节的组织。轻轻剪去最​​背的组织,而其余的从主动脉(红色线),以防止任何尼克斯足够的距离。切割主动脉会导致失血,无法轻松地可视化其位置。再次,与针的小伤口,是至关重要的,以维持一个精确的切割位置。
  14. 推出额外的组织,打开胚胎周围削减腹侧组织,再切割尽可能靠近主动脉没有knicking。削减作出的最佳位置太远,会导致腹部在场组织一次股东周年大会上是孤立的,它可以被删除。
  15. 背面朝下或对板回位置的胚胎。轻轻张开胚胎开放,推动双方和可视化的性腺脊的位置。这些稍微偏离中心,位于主动脉两侧的筒状结构。
  16. 完成剥离,去除多余的一面组织使用和以前相同的切割技术。一旦一侧的胚胎组织取出,然后胚胎是天翻地覆以清除可能剩下的一面组织。
  17. 在这一点上,股东周年大会上检查,任何多余的组织,可以轻松地去除而不伤到主动脉或性腺针。卸下为更好地隔离,因为我们只有少数的细胞表面标志物,用于净化依赖干细胞的人口远超过可能的结果。
  18. 使用弯嘴钳,轻轻舀起含10%胎牛血清,直到离解准备冷PBS在每个年度股东大会和地方。

分离和流式细胞仪分析

  1. 游离于组织,首先卵黄囊和独立管周年大会。
  2. 简单地旋转球团组织和丢弃含10%胎牛血清的PBS。
  3. 重悬在PBS的0.25%胶原酶组织含20%FBS,有足够的量,以充分涵盖组织。
  4. 在37℃孵育组织。 25周年大会和卵黄囊35 - 40分钟30分钟。
  5. 孵化结束,轻轻地吸液管组织和向下分解成单细胞悬液。
  6. 洗净过剩PBS无线的组织日10%FBS,颗粒细胞和​​悬浮在新鲜无菌PBS含10%胎牛血清。
  7. 流式细胞仪分析,细胞染色根据制造商的建议。我们自BD Biosciences公司使用一个FACSAria进行流式细胞仪检测。由于胚胎干细胞的大小和脆弱性,排序光圈调整为一个更大的直径比成人的造血细胞,我们也研究在实验室中。同样,调整的压力是要少于成人的造血干细胞所需的条件。例如,排序上的FACSAria,喷嘴大小为100微米和排序的压力将是30磅。
  8. 股东周年大会通过流式细胞仪分离干细胞的分析,三重表达的标记cKit,CD34,和CD41阳性细胞分离和卵黄囊和双阳性(cKit,CD34)排序。一个典型情节是这样的:cKit阳性细胞CD34和CD41同时或单独进行分析。通常细胞显示一个渐变的积极性,为每个作为一个积极的人口的一个子集中发现的干细胞人口的标志。这些图显示我们,我们有一个很好的细胞产量达到100-300%卵黄囊和每个股东周年大会上的细胞。

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