Молекулярная эволюция Tre рекомбиназы

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь мы сообщаем поколения Tre рекомбиназы через направлена, молекулярной эволюции. Tre рекомбиназы признает предопределенные последовательности-мишени в LTR последовательностей ВИЧ-1 провируса, в результате вырезания и искоренение провируса из инфицированных человеческих клеток. Хотя еще в зачаточном состоянии, направленной молекулярной эволюции позволит создавать собственные ферменты, которые будут служить инструментами молекулярной хирургии и молекулярной медицины.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Buchholz, F. Molecular Evolution of the Tre Recombinase. J. Vis. Exp. (15), e791, doi:10.3791/791 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Здесь мы сообщаем поколения Tre рекомбиназы через направлена, молекулярной эволюции. Tre рекомбиназы признает предопределенные последовательности-мишени в LTR последовательностей ВИЧ-1 провируса, в результате вырезания и искоренение провируса из инфицированных человеческих клеток.

Мы начали с Cre, 38-кДа рекомбиназы, который признает 34-б.п. двухцепочечной ДНК последовательность известна как loxP. Потому что Cre может эффективно устранять геномных последовательностей, мы приступаем к портному рекомбиназы, которые могли бы удалить последовательности между 5'-LTR и 3'-LTR комплексного ВИЧ-1 провируса. В качестве первого шага мы определили последовательность в LTR сайтов, которые были похожи на loxP и испытан для рекомбинации деятельности. Первоначально Cre и мутагенизированных Cre библиотеки не удалось рекомбинируют выбрали loxLTR сайты ВИЧ-1 провируса. Как начать любой направленной молекулярной эволюции процесса требует, по крайней мере остаточной активности, оригинальные асимметричные последовательности loxLTR были разделены на подмножества и повторную проверку для рекомбинации деятельности. Выступая в качестве промежуточных продуктов, рекомбинации деятельности был показан с подмножества. Далее, рекомбиназы библиотеки обогатились через повторяющийся цикл эволюции. Впоследствии, обогащенный библиотеки перетасовываются и рекомбинации. Сочетание различных мутаций доказал синергетического и рекомбиназ были созданы, которые были способны рекомбинировать loxLTR1 и loxLTR2. Это было доказательством того, что эволюционная стратегия через промежуточные может быть успешным. После общей сложности 126 циклов эволюции отдельных рекомбиназ были функционально и структурно проанализированы. Наиболее активными рекомбиназы - Tre - было 19 аминокислот изменения кислоты по сравнению с Cre. Tre рекомбиназы смог акцизного ВИЧ-1 провируса из генома ВИЧ-1 инфицированных клеток HeLa (см. "ВИЧ-1 провирусной Иссечение ДНК Использование Evolved рекомбиназы", Hauber Дж., Генриха Pette-Института экспериментальной вирусологии и иммунологии, Гамбург, Германия). Хотя еще в зачаточном состоянии, направленной молекулярной эволюции позволит создавать собственные ферменты, которые будут служить в качестве инструментов "молекулярную хирургию» и молекулярной медицины.

Comments

3 Comments

  1. Dr. Frank Buchholz,

    Its nice to listen to the talk. I have some queries about Tre recombinase.,
     
    1, to excise a fragment using cre or tre i guess, there should be two loxp sites if you are targeting HIV LTR region it should be very specific region rather conserved region. So what happens if the LTR regions tend to mutate ?
    ², Isn't molecular evolution a long process to create such an recombinase ?

    3, There are "zinc finger nuclease" which are custom made enzyme which make specific cuts at DNA. It has the ability to bind to any piece of DNA. So will this technique be useful  for making "Zinc Finger Recombinase", which has the ability to bind LTR region and excise the whole or part of HIV genome.

    Hoping for your comments

    Roshan Padmanabhan
    India  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 26, 2008 - 12:40 PM
  2. TRE can eradiction Lentiviral Vector from transducted cell fully? if Yes you can find different beatween Tat-Dependent and Tat-Independent LV as target for eradiction 5LTR-LTR3 from genome integrated sit? Sincerely

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2008 - 7:24 AM
  3. Hello Dr. Frank Bucholz,
    Have you sequenced the host cell genome in the wild type control vs. the HIV-1 infected vs Tre recombinase cells to
    definitively show where the HIV-1 genome is inserting, and that it is removed? Much evidence points to nonrandom insertion
    of the HIV-1 genome.
    Doug Cork
    MHRP/HJF (dcork@hivresearch.org)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 21, 2009 - 10:06 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics