Molecular Evolution de la recombinase Tre

Biology

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Summary

Nous rapportons ici la génération de Tre recombinase travers dirigé, l'évolution moléculaire. Tre recombinase reconnaît une séquence cible pré-définie dans les séquences LTR du provirus VIH-1, résultant en l'excision et l'éradication du provirus de cellules humaines infectées. Alors qu'il était encore à ses balbutiements, l'évolution moléculaire dirigée va permettre la création d'enzymes personnalisées qui serviront d'outils moléculaires de la chirurgie et la médecine moléculaire.

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Buchholz, F. Molecular Evolution of the Tre Recombinase. J. Vis. Exp. (15), e791, doi:10.3791/791 (2008).

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Abstract

Nous rapportons ici la génération de Tre recombinase travers dirigé, l'évolution moléculaire. Tre recombinase reconnaît une séquence cible pré-définie dans les séquences LTR du provirus VIH-1, résultant en l'excision et l'éradication du provirus de cellules humaines infectées.

Nous avons commencé avec la CRE, une recombinase de 38 kDa, qui reconnaît une séquence de 34 pb d'ADN double brin connu comme loxP. Parce que la Cre ne peut éliminer efficacement des séquences génomiques, nous avons décidé d'adapter une recombinase qui pourrait éliminer la séquence entre le 5'-LTR et 3'-LTR d'une approche intégrée du VIH-1 provirus. Dans un premier temps, nous avons identifié les séquences au sein des sites LTR qui étaient semblables à loxP et testée pour l'activité de recombinaison. Initialement Cre et mutagénisées bibliothèques Cre échoué à recombiner les sites choisis loxLTR du provirus VIH-1. Comme le début de tout processus d'évolution moléculaire dirigée nécessite au moins une activité résiduelle, les séquences originales loxLTR asymétriques ont été divisés en sous-ensembles et testés à nouveau pour l'activité de recombinaison. Agissant comme intermédiaires, l'activité de recombinaison a été montré à la sous-ensembles. Ensuite, les bibliothèques ont été enrichis par la recombinase cycles d'évolution réitératif. Par la suite, les bibliothèques ont été mélangées et enrichi recombinés. La combinaison des différentes mutations prouvé synergiques et recombinases ont été créés qui ont été capables de se recombiner et de loxLTR1 loxLTR2. Cela a été prouvé que grâce à une stratégie évolutive intermédiaires peuvent être couronnée de succès. Après un total de 126 cycles d'évolution recombinases individuels ont été fonctionnellement et structurellement analysés. La recombinase les plus actifs - Tre - avait 19 changements d'acides aminés par rapport à la CRE. Tre recombinase a pu accise du provirus VIH-1 à partir du génome du VIH-1 des cellules HeLa infectées (voir «VIH-1 Excision ADN proviral utilisant une recombinase Evolved", J. Hauber, Heinrich-Pette-Institute for Experimental Virology and Immunology, Hambourg, Allemagne). Alors qu'il était encore à ses balbutiements, l'évolution moléculaire dirigée va permettre la création d'enzymes personnalisées qui serviront d'outils de "chirurgie moléculaire" et la médecine moléculaire.

Comments

3 Comments

  1. Dr. Frank Buchholz,

    Its nice to listen to the talk. I have some queries about Tre recombinase.,
     
    1, to excise a fragment using cre or tre i guess, there should be two loxp sites if you are targeting HIV LTR region it should be very specific region rather conserved region. So what happens if the LTR regions tend to mutate ?
    ², Isn't molecular evolution a long process to create such an recombinase ?

    3, There are "zinc finger nuclease" which are custom made enzyme which make specific cuts at DNA. It has the ability to bind to any piece of DNA. So will this technique be useful  for making "Zinc Finger Recombinase", which has the ability to bind LTR region and excise the whole or part of HIV genome.

    Hoping for your comments

    Roshan Padmanabhan
    India  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 26, 2008 - 12:40 PM
  2. TRE can eradiction Lentiviral Vector from transducted cell fully? if Yes you can find different beatween Tat-Dependent and Tat-Independent LV as target for eradiction 5LTR-LTR3 from genome integrated sit? Sincerely

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2008 - 7:24 AM
  3. Hello Dr. Frank Bucholz,
    Have you sequenced the host cell genome in the wild type control vs. the HIV-1 infected vs Tre recombinase cells to
    definitively show where the HIV-1 genome is inserting, and that it is removed? Much evidence points to nonrandom insertion
    of the HIV-1 genome.
    Doug Cork
    MHRP/HJF (dcork@hivresearch.org)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 21, 2009 - 10:06 AM

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