Первичная диссоциированных мозга Допамин клеточных культур от грызунов Новорожденные

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Первичная диссоциированных культурах допамина мозга ячейки позволяют изучение характеристик пресинаптических дофаминовых нейронов. Они могут быть использованы для мониторинга в режиме реального времени высвобождение дофамина кинетики и белка / мРНК регуляторов допамина экзоцитоза. Здесь мы покажем вам, как создать эти культуры от грызунов новорожденных.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates. J. Vis. Exp. (21), e820, doi:10.3791/820 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Возможность создания первичных клеточных культур дофаминовых нейронов позволяет для изучения характеристик пресинаптических дофаминовых нейронов в отрыве от системного участии в других местах в головном мозге. В нашей лаборатории мы используем эти нейроны оценить допамина кинетики релиз использованием углеродного волокна amperometry, а также выражение уровень допамина связанных генов и белков с использованием количественных ПЦР и иммуноцитохимия. В этом видеоролике мы покажем, как мы генерируем эти культуры от грызунов новорожденных.

Процесс включает несколько этапов, в том числе покрытие корковых глиальные астроциты, кондиционирования нейронов СМИ культуре клеток глии подложки, рассечение мозга у новорожденных, пищеварение, экстракции и покрытие дофаминовых нейронов и того нейротрофических факторов обеспечить выживаемость клеток.

Применениям для таких подготовки включают электрофизиологии, иммуноцитохимия, количественный ПЦР-, видео-микроскопии (т. е. в режиме реального времени везикулярного слияния с плазматической мембраной), анализы жизнеспособность клеток и других токсикологических экранов.

Protocol

Подготовка Предшествующие культуры

Примечание: ** глиальные клетки должны быть покрыты заблаговременно, с тем, что у них есть время, чтобы размножаться и покрывает дно посуды. Для мышей с атипичными или экспериментальные генетический фон, убедитесь, что в соответствии глиальных и нейрональных культурах с точки зрения генотипа.

Примечание: ** 1-7 дней до вскрытия, подготовки свежих нейронов среднего и заменить глиальных среды в блюда с 2 мл.

Примечание: ** За день до вскрытия, следующие элементы должны быть оставлены в УФ-свете с ночлегом:

  • 4 пластины рассечение
  • 2 диссоциации флаконах с микро-магнитной мешалкой
  • 2 флакона колпачков (с 2-мя маленькими отверстиями ткнул в верхней части)
  • Разложите слайд кольца (и пальто в 70% этанола) - оставить окно открытым и
  • По крайней мере 2 полными коробками желтых (10-200 мкл) наконечники
  • 1 коробка синего (100-1000μl) наконечники

День культуры

Примечание: * Убедитесь, что не трогайте ничего, что осталось OUT для УФ ночным!

Поддержание стерильных условиях под капотом очень важно.

1) Настройка:

Примечание: ** Отложите все замороженные компоненты, чтобы сделать папаин решение.

  1. Чистая щипцы с 70% этанола. Обложка каждого наконечник с желтым кончиком стерильной пипеткой. Используйте для стерильных место кольца слайд в своей коробке.
  2. Горячая пластина:
    1. Место mini-magnetic/hot пластины под капот с 1000 мл стакан заполнен до 500-600мл дН 2 O и большой магнитной мешалкой.
    2. Место диск пенополистирола в стакане чуть выше уровня воды.
    3. Слайд термометра в маленькое отверстие в диске пенополистирола. Тепло набора должна быть чуть выше 2 (для темп 34 ° С) и перемешать набора должна быть ~ 5-6.
  3. PBS:
    1. Подготовка стерильной PBS и заполнить 15 стерильные 15 мл пробирки с 4-6 мл (не забудьте сохранить стерильный
      техники).
    2. Место труб и акции бутылки на лед рядом с капюшоном.
  4. Карбогена:
    1. Перерыв 5 мл stripette пополам и нажмите на нее через резиновую пробку, так что кончик stripette торчит широкий конец пробки.
    2. Место пробку в 500 мл колбу с 400-500мл дН 2 O (сломанный конец stripette должно быть в дН 2 O).
    3. Подключите трубку на боковое отверстие колбы.
    4. Отрежьте кончик желтый наконечник пипетки и подключить его к концу трубки (с разрезанной стороной наружу).

      Подключите карбогена бак до кончика 5 мл stripette.

  5. Подготовка папаин sol'n:
    1. * Используйте осторожно стерильной техники.
    2. Смешайте в стерильные 50 мл трубки.
  6. Фильтры папаин sol'n во флакон диссоциации:
    1. Используйте блок Steriflip фильтрации и передачи флакон 25мл диссоциации через stripette (или местом, новым 0,2 мкм фильтр шприца на кончике шприца 20мл,
      удалить поршень и использовать stripette (25 мл), чтобы передать все sol'n папаин в шприц.
    2. Фильтр в пробирку диссоциации).
    3. Крышка флакона, вставить стерильного шприца через отверстие в крышке и приложить стерильную 0,2 мкм фильтр шприца до основания шприца.
    4. Подключите карбогена к фильтру и парафильмом этом на месте. Место флаконе в пенополистирола диск / держатель.

      * Микро-магнитной мешалкой должно быть в движении.
      * Газ должен делать его в пробирку.
      * Температура должна стабилизироваться на уровне 34 ° C.

  7. Препарирование приготовительные:
    1. Принесите рассечение микроскоп под капотом.
    2. Разложите все рассечение инструментов на алюминиевую фольгу, спрей с 70% этанола, слейте избыток и оставить под капотом высохнуть.
  8. Подготовка нейронной среды:
    1. Оставьте 30 мл свежего нейронной среды в инкубаторе.
  9. Выложить один большой квадрат из алюминиевой фольги и 12 маленьких квадратов. Оставьте обезглавливание ножницы с алюминиевой фольгой. Заполните небольшую коробку пенополистирола с ледяной водой и оставьте все за пределами капотом.
  10. Подготовка анестезии (кетамин и 0.075ml 0.075ml xzylazine).
  11. Получите по крайней мере 12 щенков (P0-P2) на 100 пластин. Для мышей, убедитесь, что генотип матче за весь помет. Если генотип неизвестно, плиты клетки от каждого щенка на отдельном блюде, вести точный учет мыши цифры и сопоставить их с блюдами культуре клеток и убедитесь, что генетический фон глиальных субстрат равномерно через клеточные культуры.

2) Препарирование

  1. Обезболить первое животное с внутрибрюшинного введения. Когда животное проявляет седативного эффекта и не реагирует на хвост Флик испытаний; положил его во льду в течение 30 секунд (пока гипотермия). Промыть одной маленькой алюминиевой фольги квадрат, decapтации ножницы, и голову с 70% этанола.
  2. Обезглавьте, позволяют голову падают на алюминиевой фольги квадрат и двигаться под капотом. Аккуратно снимите мозг в 15 мл трубки ледяной PBS. Место трубку обратно на лед при удалении следующего мозга.
  3. Повторите эти первые шаги, пока Есть 3 мозги на льду. Залить все 3 мозги и PBS, на первое блюдо рассечение под микроскопом. Удалите соответствующий раздел мозга (VTA) и использовать передачу пипетки поставить сегментов в папаин sol'n. Начало таймер, когда первые сегменты войти
  4. Повторите предыдущие три действия, пока все мозги переваривается в папаин. Среднее время для переваривания пищи должен быть 2 часа. Первые сегменты были в течение приблизительно 1 часа к тому времени, последние из них войти

    Попробуйте разделить разницу.

  5. * Во время пищеварения:
    1. Убедитесь, что температура в ванне 34 ° C.
    2. Сегменты могут прилипнуть к мешалкой сначала, но должно было распространено, как время идет. Если они не будут, нажмите дне флакона.

3) Растирание:

  1. Использование передачи пипетки, передача мозга сегменты стерильные 15 мл трубки (старайтесь избегать избыточного папаин sol'n) и промыть их 3 раза с 2 мл подогретой глиальных среды из инкубатора. После сдачи глиальных СМИ в трубке, позволяющие сегментов отстояться и затем осторожно удалить как можно больше sol'n возможно, не нарушая сегментов. Изменение пипетки, чтобы избежать загрязнения!

    ** НЕ ДЕРЖИТЕ sol'n, что удаляется.

  2. Использование свежей пипетки передачи начинаются triturations в 2 мл глиальных СМИ. Растирают в 25 раз (избегайте впуская пузырьки воздуха), и пусть сидят трубку в течение 3 минут, пока недиссоциированных сегментов обосноваться. Использование передачи пипетки удалить, и держать столько sol'n возможно, не нарушая сегменты в нижней части. Держите супернатант в новой (стерильные) 15 м трубы.
  3. Повторите предыдущий шаг, используя 1000μl пипетки и 200 мкл пипетки до полного диссоциирован.
  4. Растирают в 10 раз с передачи пипетки, или пока клетки полностью ресуспендировали в sol'n.

4) Клетки Покрытие

  1. Использование стерильных желтый наконечник пипетки по каждой кончик пинцетом, осторожно удалить слайд кольцо, как в центре, чтобы стекла, а также возможные в каждом блюде.
  2. Поместите 10 мкл ячейки решение на hemacytometer и считать. (Исключить нежелательной массы).
  3. Умножьте количество клеток на 10. Это число клеток / мкл. Разделите 1,000,000-1,500,000 (или желаемой плотности) на это число. Это число мкл, чтобы добавить в блюдо.
  4. Использование пипетки скользить кольца, над центральной и каждого блюда по мере добавления соответствующих мкл / блюдо. Пластина их мягко и переключиться советов для каждого блюда.
  5. Добавить 100 мкл (из разбавленных) GDNF sol'n внутри слайд кольцо каждого блюда.
  6. В это время, место лотков в инкубаторе и принести нейронной среды в холодном помещении.
  7. Разрешить клетки решить в одночасье.
  8. Следующий день: снимите кольца (с использованием новых стерильные наконечники пипеток покрытие щипцов советов для каждого блюда)

5) Митотическая Ингибирование: СЛЕДУЮЩИЙ ДЕНЬ

  1. Развести FDU аликвоты 1000X 1:10 акции путем добавления 200 мкл фондовом FDU до 1,8 мл стерильного MEM.
  2. Добавить 20 мкл разбавленного FDU sol'n к внешнему кольцу каждого блюда. Изменение наконечники часто. Накрыть крышкой и вернуться в инкубаторе.

    * Беспокоить блюда как можно меньше в течение следующих 7-10 дней. Проверьте инфицированных блюд и удалять зараженные блюда при первых признаках инфекции. Культуры готовы для тестирования в течение 3 недель.

МЕДИА / РЕШЕНИЯ

Нейронов среднего

(На 200 мл)

** Лучше всего, если в зависимость от глии из колбы ночь перед использованием для мойки / растиранием

Ингредиент Количество Примечания
BSA 5% 0,5 г Доля V
MEM жидкости 94,0 мл Сигма
DMEM жидкости 80,0 мл Сигма
F-12 жидком 20,0 мл Сигма
Глюкоза 45% жидкости 1,50 мл Sigma решение
Глутамин 200 мМ 0,5 мл Aliquotted решение Sigma
Diporzio Конц. 2,0 мл Sigma решение
Жидкие Каталаза 0,1 мл
Кинуреновой кислоты 0,5 М 200 мкл В 1N NaOH
HCL 5N 50 мкл

  1. Комбинат ингредиенты (BSA идет последним) в 250 мл пластиковые бутылки.
  2. Фильтр, этикетки, и поставить в холодильник.

Кинуреновой кислота
(FW = 189,2)
0,5 М = 94.6mg/ml
Сделать 8ml складе: 756.8mgKA/8ml 1N NaOH и пипеткой в ​​стерильную аликвоты 200 мкл



DiPorzio СМИ

) DiPorzio Конц. Акции:

НУЖНА Объединять Alliquot
Добавка Растворитель Трубка Количество мл мл / трубки Конц. Количество # Алик.
Инсулин 20 мМ HCL (1) пластик 250 мг флакон 10 1 25mg/ml 25 мг 10
Трансферрина Хэнка 500 мг флакон 5 1 100мг/мл 100 мг 5
SOD Хэнка 70мг флакон 14 1 5mg/ml 5 мг 14
Путресцин Хэнка 50 мг 3 0,12 20mg/ml 2.4mg 21
Na 2 SeO 3 Хэнка 0.104mg 10 0,5 10μg/ml 5.2μg 20
T3 10 мМ NaOH 2мг 10 0,1 0.20mg/ml 0 мг 100
Прогестерон 100% этанола Стекло 12,5 мг 10 0,05 1.25mg/ml Используйте пипетку
Кортизол 100% этанола Стекло 20мг 10 0,02 2.00mg / мл Используйте пипетку

  1. 20 мМ HCl = 41.5μl конц. HCl/25ml.
  2. Сделать 1mg/ml акции и добавить 104μl на 10 мл.



Б) DiPorzio СМИ складе:

Добавка Сумма (мл) Сумма (мл) X2 Заключительные Конц. мкг / мл Заключительные Конц. Молярность
Прогестерон 0,05 0,1 0,06 200 нм
Кортизол 0,02 0,04 0,04 125nM
Хэнка BSS 6,21 12,42
Инсулин 1 2 25
Na 2 SeO 3 0,5 1 0,01 30нм
T3 0,1 0,2 0,02 30нм
SOD 1 2 5
Путресцин 0,12 0,24 2,4 15nM
Трансферрина 1 2 100

  1. Используйте 15 мл polyproylene стерильную пробирку добавить прогестерона и кортизола. Используйте пипетку и вакуумного аспиратора для ускорения испарения этанола: (используйте 5 мл stripette сломанный пополам и положите на полпути вниз в трубу быть очень осторожными, чтобы не аспирата EtOH жидкости Держите пипетку надежно фиксироваться Kimwipes а затем принести чаевые. до 500 мкл марка находится на стороне трубки.
  2. Добавить последующие аликвоты в порядке их появления на графике выше.
  3. После того инсулина, что делает облачно раствор, добавить 20 мкл 1 н NaOH для нейтрализации рН. Sol'n должно идти от желтого до розового и сразу ясно. Кроме того, после того трансферрина, сразу же добавить 20 мкл 1 н NaOH, чтобы нейтрализовать рН и предотвратить образование осадков.
  4. Составить 10 мл в серологические пипетки и разделить на 5 порций (одна порция).
  5. Магазин при -20 ° C.
  6. Сделать 2 мая партий сразу.

Диссоциация СМИ

А. Папаин (за 1 флакон):

** Подготовка день покрытие прямо перед рассечение.

Ингредиент Сумма </ STRONG> (Заметки) Заключительный Конц.
Цистеин воды 7.8mL 1mM цистеина
Папаин Варьируется (* 190μl за бутылку
44.0mg/ml)
20 ед / мл (400 единиц общего
за 20 мл сумму sol'n)
H & B конц. 2 мл
Карбогена 95% О2 + 5% CO2
HCl 5N 10 мкл
0,5% Фенол красный 20 мкл 0,001%
Kynurenate 0.5M 10 мкл (В 1N NaOH) 0,5 мм

  1. Добавить папаин, чтобы цистеина воду.
  2. Добавить H & B конц., Kynurenate, HCl, и фенол красный.
  3. Фильтры в флаконе диссоциации (как описано в настройке направления) и подключиться к карбогена.


B. H & B концентрата (100 мл 5 раз):

Ингредиенты МВт Powder/50ml H 2 O Конц. (М) Комбинат (мл) Заключительные Конц. (ММ)
NaCl 58,44 11,699 г 4 14,5 116
KCl 74,56 3,728 г 1 2,7 5,4
NaHCO 3 84,01 4,2 г 1 13 26
NaH 2 PO 4 * H 2 O 137,99 6,90 г 1 1 2
MgSO 4 120,38 6,019 г 1 0,5 1
ЭДТА (ED2-SS)
292 Sigma 5% (сделать
5g/100ml акций)
0,134 0,3722 0,5
Глюкоза 180 Sigma 45% 2,5 5 25
TC H 2 O 62,93

  1. Комбинат сумм со склада решений.
  2. Разделить на 4 мл аликвоты.
  3. Добавить аликвоту в цистеин водой после добавления папаин.

С. Цистеин Вода (157.5ml из 1X):

Ингредиенты МВт Компоненты
Порошок (мг)
H 2 O (мл) Сток Конц. (ММ) Комбинат (мл) Заключительные Конц. (ММ)
CaCl 2 147,2 736 10 500 0,6 1,9 мм
Цистеин 121,7 (1.5) 24 20 мм (0,02 М) 10 1,27 мм
(0.88)
TC воды 146,9

  1. Обеспечения и поддержания фондовых sol'n 0,5 М CaCl2 при 4 ° С
  2. Сделайте одно использование sol'n цистеина и в сочетании с другими ингредиентами
  3. Разделите на 10 аликвоты 15,75 мл и хранят при температуре 4 ° C


Подготовка GDNF

  1. Алиготе приготовительная:
    1. Растворите стерильный, лиофилизированный гранул 5 мкг GDNF с 2.4mL стерильной деионизированной водой. Концентрация этого GDNF sol'n = 2.08μg/mL.
    2. Распространение 2.08μg/mL GDNF sol'n в 76.9μl аликвоты в стерильные криопробирки. Это = 160ng одном флаконе.
    3. Хранить при -20 ° C.
  2. Дополнение к культурам:
    1. Оттепель 1 аликвоту на каждые 8 ​​блюд.
    2. Развести аликвоту, добавив 723.1μl нейронов СМИ / аликвоту. Это сделает sol'n из 160ng/800μl GDNF.
    3. Добавить 100 мкл этого sol'n в 2 мл среды в каждое блюдо для конечной концентрации 10ng GDNF на мл.


Подготовка FDU

FDU-sol'n 1000X складе:

Ингредиент Количество (Заметки) Заключительный Конц.
Уридина 247 мг 16,5 мг / мл
5-FDU (5-fluorodeoxyuridine) 100 мг (флакон) 6,7 мг / мл
TC воды 15 мл

  1. Сделать чуть более 15 мл 16,5 мг / мл уридина.
  2. Добавьте 15 мл уридина sol'n до 100 мг бутылка FDU сделать 6,7 мг / мл sol'n FDU.
  3. Разделить на 200 мкл аликвоты и заморозить в -20 ° C.

Развести по применению:

  1. Подавляют рост не-нервных клеток. Развести 1000X 1:10 акции путем добавления 200 мкл акции до 1,8 мл MEM.
  2. Добавить 20 мкл разбавленного FDU к внешнему кольцу каждого блюда. Изменение пипетки советы часто. Накрыть крышкой и вернуться в инкубаторе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы, описанные здесь, позволяют высоким разрешением морфологических и нейрохимических функций центральных нейронов допамина, которые иначе недоступны в системном или в естественных условиях подход.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Работа выполнена при поддержке DK065872 (ЕПС), Фонд Смит Семья премии передовых технологий в области биомедицинских исследований (ЕПС), F31 DA023760 (BMG, ЕПС) и P30 NS047243 (Тафтса центр в области нейронаук).

Materials

Materials are included in the protocol text.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
  2. Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
  3. Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
  4. Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
  5. Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).

Comments

29 Comments

  1. Excellent!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2008 - 11:03 AM
  2. I would like to thank Lauren and Emmanuel for such an excellent piece of science. I was thinking of setting up the method in my lab and the video encouraged me to do so. Sure it helps a lot!!! Hope to see more like this video in the future.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 13, 2009 - 11:59 AM
  3. Thank you very much for this wonderful protocol. I am very excited to try this out. Could you please let me know what kind of plates you used for plating the glia and where did you buy the slide rings from (catalog number perhaps). Thanks a bunch!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2009 - 4:38 PM
  4. Thank you for the comment and we are happy to help. The dishes were ordered from World Precision Instruments: FlouroDish FD35PDL-100, tissue culture dish with cover glass bottom, dish:35mm glass:²3mm. Thanks, Lauren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 11:20 AM
  5. And slide rings: Thomas 6705-R1² Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 1:57 PM
  6. can you please tell me how to separate astrocyte from neurons using serum coating. please send a protocol if possible. thanks Gaurav jain gauravjain_niper@yahoo.co.in

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:27 PM
  7. We do not have a protocol to separate astrocytes from neurons, all our cell sorting is done through immunocytochemistry on fixed tissue. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 24, 2009 - 3:21 PM
  8. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:18 AM
  9. Cortical astrocytes are the best option as the midbrain dŒs not provide as high a yield. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2009 - 7:44 AM
  10. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:28 AM
  11. Hi, the astrocytes we derive from cortical tissue (higher yield than in the midbrain).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:14 PM
  12. Hi there,

    It's great to find this info online, many thanks for submitting it. Can I ask what kind of % DA neuron yields you're getting this way?

    Cheers,

    Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 9:39 AM
  13. The yield is in the range of 40-60% if cells are plated in the presence of GDNF. Otherwise, the yield is in the range of 10-²0%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:17 PM
  14. Hi again,

    Sorry, i had one other thing to ask if I may. We have a lot of experience with hippocampal dissociated cultures and would be interested in seeing whether the midbrain cultures can work with the media we use for these (Neurobasal and variants); in trying this, is there any specific nutritional or medium requirement of DA neurons you've identified that we should be aware of, which isn't likely to be something we are already giving the hippocampal neurons? I see you include things like catalase and kynurenic acid that aren't in our medium......I presume these are to minimise oxidative and excitotoxic stress? Can i ask, do you have an idea of how much these improve the yield by? Many thanks again, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 10:36 AM
  15. As mentioned above, the single most critical factor in improving dopamine neuron yield is GDNF.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:19 PM
  16. Many thanks indeed for this information, that's really helpful. cheers,
    Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 4:46 PM
  17. Sorry, one final one from me - have you ever tried the Banker method with these? I have heard this dŒsn't work as well as having the cell layers in full contact, is this your experience? Is it very much worse? I am very interested in trying Banker because a neuronal monolayer would work much better with the microscopy set up I want to use! Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 19, 2010 - 4:59 AM
  18. No, we have not tried the Banker protocol on this.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2010 - 12:25 PM
  19. Hello, I wonder if I can ask what you coat your culture dishes with before plating astrocytes? I am finding that mouse glia may be quite sensitive to the usual things like poly-D-lysine etc. Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2010 - 9:01 AM
  20. Poly-D-lysine is fine for rat astrocytes, laminin is better for mouse astrocytes (although poly-D-lysine has also worked for us in mouse cultures).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 28, 2010 - 2:56 PM
  21. Hi, thanks for the protocol. Can you explain why you use P0-P² mice? I am looking to study early DA neurons from what would become the VTA and was planning on using embryonic brains, so wondered what the reason was for using neonatal brains here.

    Many thanks,
    Naomi

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 4, 2012 - 10:29 AM
  22. Using embryonic instead of neonatal brains with this procedure would be fine provided that you account for adequate brain development in utero. To be safe and ensure health of the dopamine cell bodies in culture, I would avoid using embryos prior to the third trimester of gestation. We have not used dissociated cultures for precursors to dopamine neurons so I am not really qualified to vouch for the viability of such preparations. Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 18, 2012 - 6:55 PM
  23. Ok, thank you!

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 19, 2012 - 4:20 AM
  24. Hi Naomi, the protocol should work with embryonic brains as well (provided you allow for development of DA neurons) but the dissection is going to be much more challenging. I would suggest you culture neurons from the midbrain (both VTA and nigra) in that case to allow for the difference in size of the brain sites you are targeting. MIcrodissection techniques may also help, but you have to find the way to get your tissue in carbogenated media ASAP.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:44 PM
  25. Thank you for posting such a great informational video. I have a follow-up question to the previous question on this page: would it also be appropriate to use postnatal day 2-5 mice instead of PN 0-2? I ask because I have seen other protocols to culture primary dopamine neurons that use older mice (for example, Smeyne and Smeyne, 2002).

    Thanks,
    Brittany W.

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    July 5, 2013 - 2:18 PM
  26. Hi Brittany, you can try with P2-P5 but it is not optimal. P0-P2 would typically give you the highest yield in live DA cells in culture, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:47 PM
  27. Thanks!

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    November 21, 2013 - 2:39 PM
  28. Hi, The protocol is explained and shown very nicely. I want to do only dopaminergic neuron culture. Is it possible to do the culture without glia or seeding it directly on poly d lysine coated plates. In your protocol you have added FDU to kill dividing cells (glia), does it kill all within and outside the ring in the plate, and you get only dopminergic cells at the end. Would you please help and suggest a bit. Thanks. Farah

    Reply
    Posted by: Farah S.
    November 20, 2013 - 10:27 AM
  29. Hi Farah, we have not been able to produce DA cell cultures without plating glia, the latter are needed to condition the media and help sustain the culture for several weeks. If you only think of acute experiments, it might be possible to isolate DA cells for a few hours, but they would have no neurites, they would be difficult to identify as DA neurons and they would die very fast. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:51 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics