ראשי ניתק דופמין במוח התיכון Cell תרבויות מן ילודים מכרסמים

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ראשי ניתק הדופמין במוח התיכון בתרביות תאים מאפשרים ללמוד את המאפיינים presynaptic של נוירונים דופמין. הם יכולים לשמש כדי לפקח בזמן אמת שחרור הדופמין קינטיקה של חלבונים / רמות ה-mRNA של הרגולטורים של exocytosis דופמין. כאן, אנו מראים לך איך לייצר מן התרבויות הללו בילודים מכרסמים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates. J. Vis. Exp. (21), e820, doi:10.3791/820 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

היכולת ליצור תרביות תאים העיקרי של נוירונים דופמין מאפשר ללמוד את המאפיינים presynaptic של נוירונים דופמין במנותק קלט מערכתית ממקומות אחרים במוח. במעבדה שלנו, אנו משתמשים אלו נוירונים להעריך קינטיקה שחרור הדופמין באמצעות סיבי פחמן amperometry, כמו גם רמות הביטוי של גנים הקשורים לדופמין חלבונים באמצעות PCR כמותי ו immunocytochemistry. בסרטון הזה, אנו מראים לך איך אנחנו מייצרים אלה תרבויות מן בילודים מכרסמים.

התהליך כולל מספר שלבים, כולל ציפוי של האסטרוציטים גליה קליפת המוח, את מיזוג של תרבות התקשורת העצבית על ידי תא המצע גליה, דיסקציה של המוח התיכון בילודים, את מערכת העיכול, מיצוי ציפוי של נוירונים דופאמין תוספת של גורמים neurotrophic ל להבטיח את הישרדות התא.

יישומים מתאימים להכנת כזה כוללים electrophysiology, immunocytochemistry, PCR כמותי, מיקרוסקופיה וידאו (כלומר, של איחוי בזמן אמת שלפוחי עם קרום התא), הכדאיות מבחני תא מסכי toxicological אחרים.

Protocol

ההכנה שקדמו תרבות

הערה: ** ותאי גלייה חייב להיות מצופה היטב מראש, כך שיש להם זמן להתרבות ולכסות את החלק התחתון של המנות. עבור עכברים עם הרקע הגנטי טיפוסיות או ניסיוני, הקפד להתאים לתרבויות גליה ואת עצבי במונחים של גנוטיפ.

הערה: ** 1-7 ימים לפני הניתוח, להכין מדיום העצבית טריים להחליף את מדיום גלייה את הכלים עם 2ml.

הערה: ** ביום שלפני הניתוח, את הפריטים הבאים צריכים להישאר תחת אור UV לילה:

  • 4 צלחות לנתיחה
  • 2 דיסוציאציה צלוחיות עם בר מיקרו מגנטי סערה
  • בקבוקון 2 כמוסות (עם 2 חורים קטנים הציצו בחלק העליון)
  • מורחים את טבעות להחליק (וגם מעיל EtOH 70%) - לעזוב את התיבה פתוחה גם
  • לפחות 2 ארגזים מלאים צהוב (10-200μl) פיפטה טיפים
  • 1 קופסה של כחול (100-1000μl) פיפטה טיפים

יום התרבות

הערה: * הקפד לא לגעת בשום דבר שנשאר בחוץ UV לילה!

שמירה על סביבה סטרילית מתחת למכסה המנוע הוא מאוד חשוב.

1) הגדרת:

הערה: ** מניחים בצד את כל החומרים הקפואים כדי להפוך פתרון papain.

  1. מלקחיים נקי EtOH עם 70%. כיסוי כל קצה עם קצה pipet סטרילי צהוב. השתמש למקום טבעות שקופיות סטרילי בתיבה שלהם.
  2. חם בצלחת:
    1. מניחים צלחת mini-magnetic/hot מתחת למכסה המנוע עם מבחנה 1000ml מלא עד 500-600ml DH 2 O ובר גדול ומערבבים מגנטי.
    2. מקום בדיסק בכוס קלקר רק מעל פני המים.
    3. החלק את המדחום בתוך חור קטן הדיסק קלקר. חיוג חום צריך להיות מעט מעל 2 (עבור טמפ של 34 מעלות צלזיוס) ואת חיוג ומערבבים יש ~ 5-6.
  3. PBS:
    1. הכן PBS סטרילי ומלא צינורות 15 מ"ל 15 מ"ל סטרילי עם 4-6 (הקפד לשמור על סטריליות
      טכניקה).
    2. מניחים את הצינורות ואת בקבוק המניות על הקרח ליד מכסה המנוע.
  4. Carbogen:
    1. לשבור stripette 5 מ"ל במחצית והעברתה דרך פקק גומי, כך קצה stripette הוא מבצבץ סוף רחב של הפקק.
    2. הנח את הפקק בבקבוק 500ml עם 400-500ml DH 2 O (סוף השבור של stripette צריך להיות 2 DH O).
    3. חיבור צינור על פתיחת בצד של הבקבוק.
    4. חותכים את קצה קצה פיפטה צהוב להתחבר זה עד הסוף של הצינור (עם הצד החתוך פונה החוצה).

      חבר את המיכל carbogen אל קצה stripette 5 מ"ל.

  5. הכן papain sol'n:
    1. * שימוש בטכניקה סטרילית זהיר.
    2. מערבבים בתוך שפופרת 50 מ"ל סטרילי.
  6. סנן papain sol'n לתוך הבקבוקון דיסוציאציה:
    1. השתמש סינון Steriflip היחידה להעביר בקבוקון דיסוציאציה דרך 25ml stripette (או המקום מסנן חדש מזרק 0.2μm על קצה מזרק הבוכנה 20ml,
      להסיר את הבוכנה ולהשתמש stripette (25mL) להעביר את כל sol'n papain לתוך המזרק.
    2. סנן לתוך הבקבוקון דיסוציאציה).
    3. שווי את הבקבוקון, להוסיף מזרק סטרילי דרך החור בכובע ולצרף מסנן סטרילי מזרק 0.2μm לבסיס של המזרק.
    4. חבר את carbogen את המסנן parafilm זה המקום. מניחים את הבקבוקון בתוך קלקר דיסק / בעל.

      * בר מיקרו מגנטי ומערבבים חייב להיות נעים.
      * גז חייב להיות מה שהופך אותו לתוך הבקבוקון.
      * הטמפרטורה חייבת לייצב את 34 ° C.

  7. Dissection הכנה:
    1. תביאו את המיקרוסקופ לנתיחה מתחת למכסה המנוע.
    2. הנח את כל הכלים לנתיחה על רדיד אלומיניום, תרסיס עם EtOH 70%, לשפוך את עודפי לעזוב מתחת למכסה המנוע לייבוש.
  8. הכן בינוני העצבית:
    1. עזוב 30 מ"ל של מדיום העצבית טרי בחממה.
  9. פריסת 1 ריבוע גדול של נייר אלומיניום ו - 12 ריבועים קטנים יותר. השאירו את המספריים עריפת ראש עם רדיד האלומיניום. מלאו קופסה קטנה הקלקר במי קרח ולהשאיר את כל מחוץ למכסה המנוע.
  10. Prep ההרדמה (קטמין 0.075ml ו 0.075ml xzylazine).
  11. קבל לפחות 12 גורים (P0-P2) עבור 100 צלחות. עבור עכברים, לוודא שיש התאמה גנוטיפ של פסולת כולו. אם גנוטיפ אינו ידוע, תאים צלחת מכל הגור על צלחת נפרדת, לשמור תיעוד מדויק של מספרים העכבר ולהתאים אותם עם צלחות תרבית תאים ולוודא את הרקע הגנטי של המצע גליה אחידה על פני תרביות תאים.

2) Dissection

  1. להרדים את בעל החיים הראשון עם זריקה intraperitoneal. כאשר החיה מראה הרגעה ולא מגיב לבדוק זנב קפיצי, לשים אותו קרח למשך 30 שניות (עד היפותרמיים). יש לשטוף אחת קטנה רדיד אלומיניום מרובע, decapitation מספריים, וראש EtOH עם 70%.
  2. לערוף, לאפשר לראש ליפול על ריבוע רדיד אלומיניום ולעבור מתחת למכסה המנוע. להסיר בעדינות את המוח לתוך שפופרת של 15 מ"ל קר כקרח PBS. מניחים את הצינור בחזרה על קרח תוך הסרת המוח הבא.
  3. חזור על שלבים אלה הראשונה עד ישנם 3 מוחות על הקרח. יוצקים את כל 3 מוחות PBS על צלחת את הנתיחה הראשונה מתחת למיקרוסקופ. הסר בסעיף המתאים של המוח (VTA) ולהשתמש pipet להעביר את קטעי לתוך papain sol'n. התחל טיימר כאשר מגזרים הראשון ללכת פנימה
  4. חזור על צעדים 3 עד שכל המוחות נמצאים מתעכל ב papain. הזמן הממוצע לעיכול צריך להיות 2 שעות. קטעי הראשון יהיה כבר שעה על 1 עד האחרונים להיכנס

    נסה לפצל את ההבדל.

  5. * במהלך עיכול:
    1. ודא זמני באמבטיה היא 34 ° C.
    2. מגזרי יכול לדבוק הבר לבחוש בהתחלה, אבל צריך להתפשט ככל שעובר הזמן. אם לא, הקש על החלק התחתון של המכל.

3) טחינה דקה:

  1. בעזרת פיפטה העברה, להעביר את קטעי המוח שפופרת 15 מ"ל סטרילי (נסו להימנע מעודף papain sol'n) ולשטוף אותם 3 פעמים עם 2ml של המדיום גליה חימם מן החממה. לאחר שהחנה את כלי התקשורת גליה בצינור, לאפשר מגזרים להתיישב ואז להסיר בזהירות כמו sol'n האפשר מבלי להפריע מגזרים. שנה pipettes כדי למנוע זיהום!

    ** לא שומרים sol'n כי יוסר.

  2. בעזרת פיפטה העברת טרי להתחיל triturations ב 2ml התקשורת גליה. Triturate 25 פעמים (להימנע מכניסה פנימה בועות אוויר) ולתת הצינור לשבת במשך 3 דקות, עד קטעים undissociated להתיישב. השתמש פיפטה העברת להסיר שמור sol'n ככל האפשר מבלי להפריע מגזרים בתחתית. שמור את supernatant בצינור (סטרילי) חדש 15m.
  3. חזור על השלב הקודם בעזרת פיפטה 1000μl ו פיפטה 200μl עד ניתק לחלוטין.
  4. Triturate 10 פעמים עם פיפטה העברה, או עד התאים resuspended לחלוטין sol'n.

4) ציפוי תאים

  1. בעזרת פיפטה סטרילית קצה צהוב מכסה כל קצה מלקחיים, בזהירות טיפה טבעת להחליק מרוכז כמו לזכוכית טוב ככל האפשר בתוך כל מנה.
  2. שים 10μl של פתרון התא על hemacytometer ו לספור. (תכלול ההמונים זבל).
  3. תכפיל את מספר התאים על ידי 10. זהו את מספר התאים / μl. הפרד 1,000,000-1,500,000 (או צפיפות הרצוי) על ידי מספר זה. זהו המספר של μl להוסיף לכל מאכל.
  4. השתמש קצה פיפטה להחליק טבעות על מרכז טוב של כל מנה ככל שתוסיף μl המנה המתאימה /. פלייט אותם בעדינות ולעבור טיפים כל מאכל.
  5. הוסף 100μl (של בדילול מלא) sol'n GDNF בתוך הטבעת שקופיות של כל מנה.
  6. בשלב זה, במקום מגשי בחממה ולהביא את עצבי בינוני בחדר קר.
  7. אפשר תאים ליישב בין לילה.
  8. למחרת: טבעות להסיר (בעזרת פיפטה סטרילית טיפים חדשים המכסים את הטיפים מלקחיים עבור כל מנה)

5) עיכוב mitotic: למחרת

  1. מדולל aliquots FDU של 1:10 המניות 1000x ידי הוספת 200μl מניות FDU כדי ממ 1.8 מ"ל סטרילי.
  2. הוסף 20μl בדילול FDU sol'n לטבעת החיצונית של כל מנה. שינוי עצות פיפטה לעתים קרובות. מכסים לחזור החממה.

    * להפריע את הכלים מעט ככל האפשר בימים 7-10 הבא. בדוק מנות נגועים ולהסיר כל המנות נגוע ב סימנים ראשונים של זיהום. תרבויות מוכנים לבדיקה תוך 3 שבועות.

MEDIA / פתרונות

עצבי בינוני

(עבור 200 מ"ל)

** הטוב ביותר אם מותנה גליה מ צלוחיות לילה לפני השימוש עבור רוחץ / טחינה דקה

מרכיב כמות הערות
BSA 5% 0.5 גרם שבר V
ממ נוזלי 94.0 מ"ל סיגמא
DMEM נוזלי 80.0 מ"ל סיגמא
F-12 נוזלי 20.0 מ"ל סיגמא
גלוקוז 45% נוזל 1.50 מ"ל סיגמא פתרון
גלוטמין 200mm 0.5 מ"ל פתרון Aliquotted סיגמא
Diporzio קונצרט כלשהו. 2.0 מ"ל סיגמא פתרון
נוזלי Catalase 0.1 מ"ל
חומצה Kynurenic 0.5m 200μl ב 1N NaOH
HCL 5N 50 μl

  1. שילוב החומרים (BSA הולך אחרון) ב 250אני בקבוק פלסטיק.
  2. התווית סינון, ושומרים במקרר.

Kynurenic חומצה
(FW = 189.2)
0.5m = 94.6mg/ml
הפוך את המניות 8ml: 756.8mgKA/8ml NaOH 1N ו פיפטה לתוך aliquots סטרילי של 200μl



DiPorzio מדיה

א) DiPorzio קונצרט כלשהו. מניות:

NEED לשלב Alliquot
תוסף ממס שפופרת כמות מ"ל מ"ל / שפופרת קונצרט כלשהו. כמות # Aliq.
אינסולין HCL 20mm (1) פלסטי טבליות של 250 בקבוק 10 1 25mg/ml 25mg 10
Transferrin הנק של 500 מ"ג בקבוק 5 1 100mg/ml 100 מ"ג 5
SOD הנק של 70mg בקבוק 14 1 5mg/ml 5mg 14
Putrescine הנק של 50 מ"ג 3 0.12 20mg/ml 2.4mg 21
Na 2 3 SEO הנק של 0.104mg 10 0.5 10μg/ml 5.2μg 20
T3 10mm NaOH 2mg 10 0.1 0.20mg/ml 0mg 100
הפרוגסטרון 100% EtOH זכוכית 12.5mg 10 0.05 1.25mg/ml השתמש pipet
קורטיזול 100% EtOH זכוכית 20mg 10 0.02 2.00mg / ml השתמש pipet

  1. 20mm HCl = 41.5μl קונצרט כלשהו. HCl/25ml.
  2. הפוך את המניות 1mg/ml ולהוסיף 104μl ל 10 מ"ל.



ב) מלאי DiPorzio מדיה:

תוסף סכום (מ"ל) (מ"ל) סכום X2 סופי קונצרט כלשהו. מיקרוגרם / מ"ל סופי קונצרט כלשהו. Molarity
הפרוגסטרון 0.05 0.1 0.06 200nM
קורטיזול 0.02 0.04 0.04 125nM
האנק של BSS 6.21 12.42
אינסולין 1 2 25
Na 2 3 SEO 0.5 1 0.01 30nm
T3 0.1 0.2 0.02 30nm
SOD 1 2 5
Putrescine 0.12 0.24 2.4 15nM
Transferrin 1 2 100

  1. השתמש צינור polyproylene 15 מ"ל סטרילי כדי להוסיף את פרוגסטרון קורטיזול. השתמש pipet aspirator ואקום כדי לזרז אידוי של EtOH: (להשתמש stripette 5 מ"ל שבור לשניים מקום בחצי הדרך למטה לתוך הצינור נזהר מאוד שלא לשאוב נוזל EtOH החזק pipet בבטחה במקום עם Kimwipes ואז להביא את קצה. למטה כדי לסמן את 500μl ממוקם בצד של הצינור.
  2. מוסיפים את aliquots הבאים לפי הסדר שהם מופיעים בתרשים לעיל.
  3. לאחר תוספת של אינסולין, מה שהופך את מעונן sol'n, להוסיף 20μl של 1N NaOH לנטרל את החומציות. Sol'n צריך ללכת מצהוב ורוד ברור מיד. כמו כן, לאחר תוספת של transferrin, מיד להוסיף 20μl של 1N NaOH, כדי לנטרל את החומציות ומניעת היווצרות משקעים.
  4. צייר את 10ml לתוך pipet לחלק סרולוגיות לתוך 5 aliquots (צרור אחד).
  5. חנות @ -20 ° C.
  6. מאי לעשות 2 קבוצות בבת אחת.

דיסוציאציה מדיה

א Papain (עבור בקבוקון 1):

** היכונו ליום של ציפוי ממש לפני לנתיחה.

מרכיב סכום </ Strong> (הערות) סופי קונצרט כלשהו.
ציסטאין מים 7.8mL 1mm ציסטאין
Papain משתנה (* 190μl לבקבוק של
44.0mg/ml)
20 יחידות / מ"ל ​​(400 יחידות סה"כ
עבור שווה 20ml של sol'n)
H & B קונצרט כלשהו. 2ml
Carbogen 95% O2 CO2 + 5%
HCl 5N 10μl
פנול אדום 0.5% 20μl 0.001%
Kynurenate 0.5m 10μl (ב 1N NaOH) 0.5mm

  1. הוסף papain למים ציסטאין FIRST.
  2. הוסף את H & B קונצרט כלשהו., Kynurenate, HCl, פנול אדום.
  3. סנן לתוך בקבוקון דיסוציאציה (כפי שמתואר הגדרת כיוונים) ולהתחבר carbogen.


ב H & B תרכיז (100 מ"ל של 5X):

המצרכים MW Powder/50ml H 2 O קונצרט כלשהו. (ז) מערבבים (מ"ל) סופי קונצרט כלשהו. (מ"מ)
NaCl 58.44 11.699 גרם 4 14.5 116
KCl 74.56 3.728 גרם 1 2.7 5.4
NaHCO 3 84.01 4.2 גרם 1 13 26
לאא 2 PO 4 * H 2 O 137.99 6.90 גר ' 1 1 2
MgSO 4 120.38 6.019 גרם 1 0.5 1
EDTA (ED2-SS)
292 סיגמא 5% (לעשות
5g/100ml המלאי)
0.134 .3722 0.5
גלוקוז 180 Sigma 45% 2.5 5 25
TC H 2 O 62.93

  1. מערבבים כמויות מפתרונות המניות.
  2. מתחלקים aliquots 4ml.
  3. הוסף aliquot למים ציסטאין לאחר הוספת papain.

ג מים ציסטאין (157.5ml של 1X):

המצרכים MW רכיבי
אבקת (מ"ג)
H 2 O (מ"ל) במלאי קונצרט כלשהו. (מ"מ) מערבבים (מ"ל) סופי קונצרט כלשהו. (מ"מ)
CaCl 2 147.2 736 10 500 0.6 1.9mM
ציסטאין 121.7 (1.5) 24 20mm (0.02M) 10 1.27mM
(0.88)
TC מים 146.9

  1. הפוך לשמור sol'n המניות של CaCl2 0.5m ב 4 ° C
  2. הפוך sol'n אחד להשתמש של ציסטאין בשילוב עם מרכיבים אחרים
  3. מתחלקים aliquots של 10 מ"ל 15.75 ולאחסן ב 4 ° C


GDNF הכנה

  1. Aliquot הכנה:
    1. ממיסים סטרילי, גלולה lyophilized של 5μg GDNF עם 2.4mL מים deionized סטרילית. ריכוז זה sol'n GDNF = 2.08μg/mL.
    2. הפץ את GDNF 2.08μg/mL sol'n לתוך 76.9μl aliquots ב cryovials סטרילית. זה 160ng = לכל בקבוקון.
    3. חנות ב -20 ° C.
  2. בנוסף תרבויות:
    1. להפשיר 1 aliquot לכל 8 מנות.
    2. מדולל aliquot ידי הוספת 723.1μl התקשורת העצבית / aliquot. זה יגרום sol'n של 160ng/800μl GDNF.
    3. הוסף 100μl של sol'n זה 2ml של המדיום בצלחת עבור כל הריכוז הסופי של 10ng GDNF לכל מ"ל.


FDU הכנה

FDU-sol'n 1000x במלאי:

מרכיב כמות (הערות) סופי קונצרט כלשהו.
Uridine 247 מ"ג 16.5 מ"ג / מ"ל
5-FDU (5-fluorodeoxyuridine) 100 מ"ג (בקבוק) 6.7 מ"ג / מ"ל
TC מים 15 מ"ל

  1. בצע קצת מעל 15 מ"ל של uridine מ"ג / מ"ל ​​16.5.
  2. הוסף 15 מ"ל uridine sol'n לבקבוק 100 מ"ג FDU לעשות 6.7 מ"ג / מ"ל ​​sol'n FDU.
  3. מתחלקים aliquots 200μl ולהקפיא ב -20 ° C.

מדולל שימוש:

  1. לעכב את הצמיחה של תאים לא עצביים. מדולל 1:10 המניות 1000x ידי הוספת מניות 200μl כדי ממ 1.8 מ"ל.
  2. הוסף FDU בדילול 20μl לטבעת החיצונית של כל מנה. שינוי עצות pipet לעתים קרובות. מכסים לחזור החממה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטות שתוארו כאן לאפשר רזולוציה נאה של תכונות מורפולוגיות neurochemical של נוירונים דופמין מרכזית אחרת הם לא זמינים מערכתית או גישת vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

העבודה נתמכה על ידי DK065872 (ENP), קרן משפחת סמית פרס הצטיינות במחקר ביו (ENP), F31 DA023760 (BMG, ENP) ו P30 NS047243 (Tufts המרכז Neuroscience Research).

Materials

Materials are included in the protocol text.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
  2. Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
  3. Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
  4. Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
  5. Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).

Comments

29 Comments

  1. Excellent!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2008 - 11:03 AM
  2. I would like to thank Lauren and Emmanuel for such an excellent piece of science. I was thinking of setting up the method in my lab and the video encouraged me to do so. Sure it helps a lot!!! Hope to see more like this video in the future.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 13, 2009 - 11:59 AM
  3. Thank you very much for this wonderful protocol. I am very excited to try this out. Could you please let me know what kind of plates you used for plating the glia and where did you buy the slide rings from (catalog number perhaps). Thanks a bunch!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2009 - 4:38 PM
  4. Thank you for the comment and we are happy to help. The dishes were ordered from World Precision Instruments: FlouroDish FD35PDL-100, tissue culture dish with cover glass bottom, dish:35mm glass:²3mm. Thanks, Lauren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 11:20 AM
  5. And slide rings: Thomas 6705-R1² Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 1:57 PM
  6. can you please tell me how to separate astrocyte from neurons using serum coating. please send a protocol if possible. thanks Gaurav jain gauravjain_niper@yahoo.co.in

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:27 PM
  7. We do not have a protocol to separate astrocytes from neurons, all our cell sorting is done through immunocytochemistry on fixed tissue. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 24, 2009 - 3:21 PM
  8. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:18 AM
  9. Cortical astrocytes are the best option as the midbrain dŒs not provide as high a yield. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2009 - 7:44 AM
  10. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:28 AM
  11. Hi, the astrocytes we derive from cortical tissue (higher yield than in the midbrain).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:14 PM
  12. Hi there,

    It's great to find this info online, many thanks for submitting it. Can I ask what kind of % DA neuron yields you're getting this way?

    Cheers,

    Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 9:39 AM
  13. The yield is in the range of 40-60% if cells are plated in the presence of GDNF. Otherwise, the yield is in the range of 10-²0%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:17 PM
  14. Hi again,

    Sorry, i had one other thing to ask if I may. We have a lot of experience with hippocampal dissociated cultures and would be interested in seeing whether the midbrain cultures can work with the media we use for these (Neurobasal and variants); in trying this, is there any specific nutritional or medium requirement of DA neurons you've identified that we should be aware of, which isn't likely to be something we are already giving the hippocampal neurons? I see you include things like catalase and kynurenic acid that aren't in our medium......I presume these are to minimise oxidative and excitotoxic stress? Can i ask, do you have an idea of how much these improve the yield by? Many thanks again, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 10:36 AM
  15. As mentioned above, the single most critical factor in improving dopamine neuron yield is GDNF.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:19 PM
  16. Many thanks indeed for this information, that's really helpful. cheers,
    Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 4:46 PM
  17. Sorry, one final one from me - have you ever tried the Banker method with these? I have heard this dŒsn't work as well as having the cell layers in full contact, is this your experience? Is it very much worse? I am very interested in trying Banker because a neuronal monolayer would work much better with the microscopy set up I want to use! Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 19, 2010 - 4:59 AM
  18. No, we have not tried the Banker protocol on this.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2010 - 12:25 PM
  19. Hello, I wonder if I can ask what you coat your culture dishes with before plating astrocytes? I am finding that mouse glia may be quite sensitive to the usual things like poly-D-lysine etc. Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2010 - 9:01 AM
  20. Poly-D-lysine is fine for rat astrocytes, laminin is better for mouse astrocytes (although poly-D-lysine has also worked for us in mouse cultures).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 28, 2010 - 2:56 PM
  21. Hi, thanks for the protocol. Can you explain why you use P0-P² mice? I am looking to study early DA neurons from what would become the VTA and was planning on using embryonic brains, so wondered what the reason was for using neonatal brains here.

    Many thanks,
    Naomi

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 4, 2012 - 10:29 AM
  22. Using embryonic instead of neonatal brains with this procedure would be fine provided that you account for adequate brain development in utero. To be safe and ensure health of the dopamine cell bodies in culture, I would avoid using embryos prior to the third trimester of gestation. We have not used dissociated cultures for precursors to dopamine neurons so I am not really qualified to vouch for the viability of such preparations. Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 18, 2012 - 6:55 PM
  23. Ok, thank you!

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 19, 2012 - 4:20 AM
  24. Hi Naomi, the protocol should work with embryonic brains as well (provided you allow for development of DA neurons) but the dissection is going to be much more challenging. I would suggest you culture neurons from the midbrain (both VTA and nigra) in that case to allow for the difference in size of the brain sites you are targeting. MIcrodissection techniques may also help, but you have to find the way to get your tissue in carbogenated media ASAP.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:44 PM
  25. Thank you for posting such a great informational video. I have a follow-up question to the previous question on this page: would it also be appropriate to use postnatal day 2-5 mice instead of PN 0-2? I ask because I have seen other protocols to culture primary dopamine neurons that use older mice (for example, Smeyne and Smeyne, 2002).

    Thanks,
    Brittany W.

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    July 5, 2013 - 2:18 PM
  26. Hi Brittany, you can try with P2-P5 but it is not optimal. P0-P2 would typically give you the highest yield in live DA cells in culture, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:47 PM
  27. Thanks!

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    November 21, 2013 - 2:39 PM
  28. Hi, The protocol is explained and shown very nicely. I want to do only dopaminergic neuron culture. Is it possible to do the culture without glia or seeding it directly on poly d lysine coated plates. In your protocol you have added FDU to kill dividing cells (glia), does it kill all within and outside the ring in the plate, and you get only dopminergic cells at the end. Would you please help and suggest a bit. Thanks. Farah

    Reply
    Posted by: Farah S.
    November 20, 2013 - 10:27 AM
  29. Hi Farah, we have not been able to produce DA cell cultures without plating glia, the latter are needed to condition the media and help sustain the culture for several weeks. If you only think of acute experiments, it might be possible to isolate DA cells for a few hours, but they would have no neurites, they would be difficult to identify as DA neurons and they would die very fast. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:51 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics