प्राथमिक dissociated कृंतक नवजात शिशुओं से midbrain dopamine सेल संस्कृतियों

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

प्राथमिक dissociated midbrain dopamine सेल संस्कृतियों dopamine न्यूरॉन्स के presynaptic विशेषताओं के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं. वे वास्तविक समय dopamine जारी कैनेटीक्स और प्रोटीन / mRNA डोपामाइन exocytosis के नियामकों के स्तर की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ, हम आपको बताते हैं कैसे कृंतक नवजात शिशुओं से इन संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates. J. Vis. Exp. (21), e820, doi:10.3791/820 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

dopamine न्यूरॉन्स की प्राथमिक सेल संस्कृतियों बनाने की क्षमता मस्तिष्क में कहीं से प्रणालीगत इनपुट से अलगाव में dopamine न्यूरॉन्स के presynaptic विशेषताओं के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. हमारी प्रयोगशाला में, हम इन न्यूरॉन्स का उपयोग करने dopamine जारी कार्बन फाइबर amperometry, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से डोपामाइन से संबंधित जीन और मात्रात्मक पीसीआर और immunocytochemistry का उपयोग प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर का उपयोग कैनेटीक्स का आकलन. इस वीडियो में, हम आपको बताएंगे कि कैसे हम कृंतक नवजात शिशुओं से इन संस्कृतियों उत्पन्न.

प्रक्रिया cortical glial astrocytes के चढ़ाना, glial सब्सट्रेट द्वारा neuronal सेल संस्कृति मीडिया की कंडीशनिंग, नवजात शिशुओं में midbrain के विच्छेदन, पाचन, निष्कर्षण और dopamine न्यूरॉन्स की चढ़ाना और neurotrophic कारकों में से करने के अलावा सहित कई कदम शामिल सेल अस्तित्व को सुनिश्चित करते हैं.

इस तरह के एक तैयार करने के लिए उपयुक्त अनुप्रयोगों इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, immunocytochemistry, मात्रात्मक पीसीआर, वीडियो माइक्रोस्कोपी (यानी, प्लाज्मा झिल्ली के साथ वास्तविक समय vesicular संलयन), सेल व्यवहार्यता assays और अन्य विषाक्तता स्क्रीन शामिल हैं.

Protocol

संस्कृति पूर्ववर्ती तैयारी

नोट: ** Glial कोशिकाओं अग्रिम में अच्छी तरह से मढ़वाया चाहिए ताकि वे पैदा करना और व्यंजन के नीचे कवर है. Atypical या प्रयोगात्मक आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ चूहों के लिए, जीनोटाइप के मामले में glial और neuronal संस्कृतियों मैच सुनिश्चित करें.

नोट: *** 1-7 दिनों विच्छेदन से पहले, ताजा neuronal मध्यम तैयार करने और glial मध्यम 2ml के साथ बर्तन में जगह.

नोट: ** विच्छेदन पहले दिन, निम्नलिखित मदों के लिए यूवी रात में रोशनी के नीचे छोड़ दिया करने की आवश्यकता है:

  • 4 विच्छेदन प्लेटें
  • 2 हलचल माइक्रो चुंबकीय पट्टी के साथ पृथक्करण शीशियों
  • 2 शीशी टोपी (2 छोटे शीर्ष में poked छेद के साथ)
  • बाहर स्लाइड के छल्ले और (70% EtOH में कोट) स्प्रेड - छोड़ बॉक्स भी खोल
  • पीला (10 200μl) विंदुक युक्तियाँ के कम से कम 2 पूर्ण बक्से
  • नीले रंग के 1 बॉक्स (100 1000μl) विंदुक युक्तियाँ

संस्कृति दिवस

नोट: * कुछ भी है कि बाहर यूवी के लिए छोड़ दिया गया था रात भर छू नहीं सुनिश्चित करें !

हुड के नीचे एक बाँझ वातावरण बनाए रखने बहुत महत्वपूर्ण है.

1) सेट अप:

नोट: ** अलग सेट सभी जमे हुए papain समाधान बनाने के सामग्री .

  1. 70% EtOH साथ साफ़ संदंश. एक बाँझ पीले pipet टिप के साथ कवर एक टिप. उनके बॉक्स में बाँझ स्लाइड छल्ले जगह का उपयोग करें.
  2. गरम प्लेट:
    1. एक 1000ml DH 500-600ml 2 हे और एक बड़ी चुंबकीय हलचल पट्टी से भरा बीकर के साथ हुड के नीचे एक mini-magnetic/hot थाली प्लेस .
    2. पानी के स्तर से ऊपर सिर्फ बीकर में एक स्टायरोफोम डिस्क प्लेस.
    3. थर्मामीटर स्टायरोफोम डिस्क में एक छोटे से छेद में स्लाइड. हीट डायल की जरूरत करने के लिए 2 से थोड़ा ऊपर हो (34 ° C के लिए एक अस्थायी) और हलचल डायल ~ 5-6 होना चाहिए.
  3. पीबीएस:
    1. बाँझ पीबीएस तैयार है और 4-6 मिलीलीटर के साथ 15 बाँझ 15ml ट्यूबों को भरने (बाँझ बनाए रखने के लिए सुनिश्चित हो
      तकनीक).
    2. हुड के बगल में बर्फ पर ट्यूबों और शेयर की बोतल रखें.
  4. Carbogen:
    1. आधे में एक 5ml stripette तोड़ और यह एक रबर डाट के माध्यम से धक्का है, तो stripette की नोक डाट के व्यापक अंत चिपके हुए है.
    2. DH 400-500ml 2 हे (stripette की टूटी हुई अंत DH 2 हे में होना चाहिए) के साथ एक 500ml फ्लास्क में डाट रखें .
    3. कुप्पी की ओर खोलने पर एक ट्यूब कनेक्ट.
    4. एक पीला विंदुक टिप बंद टिप कट और ट्यूब के अंत (कटौती पक्ष के साथ बाहर का सामना करना पड़) करने के लिए इस कनेक्ट.

      5ml stripette की टिप करने के लिए carbogen टैंक कनेक्ट.

  5. Papain sol'n तैयार:
    1. * सावधान बाँझ तकनीक का प्रयोग करें.
    2. एक बाँझ 50ml ट्यूब में मिक्स.
  6. हदबंदी शीशी में फ़िल्टर papain sol'n:
    1. 25ml (stripette जगह या एक नया एक 20ml गोताख़ोर सिरिंज की नोक पर 0.2μm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से एक Steriflip निस्पंदन इकाई और पृथक्करण शीशी के लिए स्थानांतरण का प्रयोग करें,
      सवार को हटाने और एक stripette (25ml) का उपयोग सिरिंज में papain sol'n के सभी हस्तांतरण.
    2. फ़िल्टर हदबंदी शीशी में).
    3. शीशी कैप, टोपी में छेद के माध्यम से एक बाँझ सिरिंज डालने और सिरिंज के आधार पर एक बाँझ 0.2μm सिरिंज फिल्टर देते हैं.
    4. फिल्टर और parafilm में इस जगह को carbogen कनेक्ट. डिस्क धारक / स्टायरोफोम में शीशी प्लेस.

      * माइक्रो चुंबकीय पट्टी हलचल बढ़ जाना चाहिए.
      * गैस शीशी में इसे बनाने जरूरी है.
      * तापमान 34 पर स्थिर जरूरी ° सी.

  7. विच्छेदन प्रस्तुत करने:
    1. हुड के अंतर्गत विच्छेदन खुर्दबीन लाओ.
    2. एल्यूमीनियम पन्नी पर विच्छेदन यंत्र लेटाओ, 70% EtOH के साथ स्प्रे, बंद अतिरिक्त डालना और हुड के नीचे के लिए सूखी छोड़ दें.
  8. Neuronal मध्यम तैयार:
    1. इनक्यूबेटर में ताजा neuronal माध्यम से 30ml छोड़ें.
  9. 1 एल्यूमीनियम पन्नी के बड़े वर्ग और 12 छोटे वर्गों बाहर लेटाओ. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कत्ल कैंची छोड़ दें. बर्फ के पानी के साथ एक छोटे से स्टायरोफोम बॉक्स भरें और डाकू के सभी बाहर छोड़.
  10. तैयारी (0.075ml ketamine और 0.075ml xzylazine) संज्ञाहरण.
  11. 100 प्लेटों के लिए कम से कम 12 पिल्ले (P0-P2). चूहों के लिए, सुनिश्चित करें कि वहाँ पूरे कूड़े के लिए एक जीनोटाइप मैच है. यदि जीनोटाइप अज्ञात है, एक अलग पकवान पर प्रत्येक पिल्ला से थाली की कोशिकाओं, माउस संख्या की सही रिकॉर्ड रखने और उन्हें मैच सेल संस्कृति व्यंजन के साथ और सुनिश्चित करें कि glial सब्सट्रेट के आनुवंशिक पृष्ठभूमि सेल संस्कृतियों भर में एक समान है.

2) विच्छेदन

  1. एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ पहली जानवर anesthetize. जब जानवर बेहोश करने की क्रिया से पता चलता है और पूंछ झटका परीक्षण के लिए जवाब नहीं, यह (hypothermic जब तक) 30 सेकंड के लिए बर्फ में डाल दिया. एक छोटे से एल्यूमीनियम पन्नी वर्ग, decap कुल्लाitation, कैंची, और 70% EtOH के साथ सिर.
  2. सिर काटना, सिर एल्यूमीनियम पन्नी वर्ग पर गिर करने के लिए और हुड के नीचे कदम की अनुमति. धीरे ठंडा पीबीएस के 15ml ट्यूब में मस्तिष्क को हटा दें. जबकि अगले मस्तिष्क को हटाने ट्यूब बर्फ पर वापस प्लेस.
  3. ये पहला कदम दोहराएँ जब तक वहाँ बर्फ पर 3 दिमाग हैं. खुर्दबीन के तहत पहली विच्छेदन पकवान पर सभी 3 दिमाग और पीबीएस डालो. मस्तिष्क के उपयुक्त अनुभाग (VTA) निकालें और एक स्थानान्तरण pipet उपयोग papain sol'n में खंडों को डाल. जब पहली क्षेत्रों अंदर जाना एक टाइमर प्रारंभ
  4. पिछले 3 चरणों को दोहराएँ जब तक सभी दिमाग papain में पचा रहे हैं किया जा रहा है. पाचन के लिए औसत समय दो घंटे का होना चाहिए. पहली क्षेत्रों के बारे में 1 घंटे के लिए समय पिछले वाले अंदर जाना द्वारा किया गया होगा

    अंतर विभाजन की कोशिश करो.

  5. * पाचन के दौरान:
    1. सुनिश्चित करें कि स्नान में अस्थायी 34 डिग्री सेल्सियस
    2. अनुभाग पहली बार में हलचल पट्टी करने के लिए छड़ी सकता है, लेकिन बाहर फैल के रूप में समय पर चला जाता है चाहिए. यदि वे नहीं करते हैं, शीशी के नीचे नल.

3) Trituration:

  1. एक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, एक बाँझ 15ml ट्यूब (अतिरिक्त papain sol'n से बचने की कोशिश) मस्तिष्क क्षेत्रों हस्तांतरण और उन्हें इनक्यूबेटर से गरम glial माध्यम के 2ml के साथ 3 बार धोने. ट्यूब में glial मीडिया डालने के बाद, खंडों को व्यवस्थित और क्षेत्रों को परेशान बिना तो ध्यान से संभव के रूप में ज्यादा sol'n के रूप में निकाल अनुमति देते हैं. Pipettes बदलें करने के लिए संक्रमण से बचने के लिए!

    ** हटा दिया है कि sol'n नहीं रखते.

  2. एक ताजा हस्तांतरण विंदुक का उपयोग glial मीडिया के 2ml में triturations शुरू. 25 बार (हवा बुलबुले में दे से बचने के लिए) Triturate और ट्यूब 3 मिनट के लिए बैठ, जब तक undissociated क्षेत्रों बसा. हटाने और नीचे में खंडों को परेशान बिना संभव के रूप में के रूप में ज्यादा sol'n रखने हस्तांतरण विंदुक प्रयोग करें. एक नया (बाँझ) 15 ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला रखें.
  3. पिछले जब तक पूरी तरह से अलग एक 1000μl पिपेट और 200μl विंदुक का उपयोग कर कदम दोहराएँ.
  4. एक हस्तांतरण विंदुक के साथ 10 बार Triturate, या जब तक कोशिकाओं को पूरी तरह से sol'n में resuspended हैं.

4) चढ़ाना कक्ष

  1. एक बाँझ पीले विंदुक टिप संदंश के प्रत्येक टिप कवर का प्रयोग, ध्यान से एक स्लाइड के रूप में प्रत्येक पकवान अंदर कांच के रूप में संभव के रूप में अच्छी तरह से केंद्रित अंगूठी ड्रॉप.
  2. सेल के समाधान के 10μl hemacytometer और गिनती पर रखो. (कबाड़ जनता अपवर्जित).
  3. कक्षों की संख्या को 10 से गुणा करें. यह कोशिकाओं की संख्या / μl है. इस संख्या से 1,000,000-1,500,000 (या वांछित घनत्व) फूट डालो. यह पकवान प्रति जोड़ने μl की संख्या है.
  4. पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए हर डिश के केंद्र से अधिक अच्छी तरह से छल्ले स्लाइड के रूप में आप उचित μl / पकवान जोड़ने के लिए. उन्हें धीरे प्लेट और हर डिश के लिए सुझावों स्विच.
  5. (पतला के) 100μl प्रत्येक पकवान की स्लाइड की अंगूठी के अंदर GDNF sol'n जोड़ें.
  6. इस समय, इनक्यूबेटर में ट्रे जगह और ठंडे कमरे में neuronal मध्यम लाना.
  7. कोशिकाओं रातोंरात व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें.
  8. अगले दिन: हटायें छल्ले (नए बाँझ विंदुक सुझावों हर डिश के लिए संदंश सुझावों को कवर का उपयोग)

5) mitotic निषेध: अगले दिन

  1. 1.8 मिलीलीटर बाँझ सदस्य 200μl FDU शेयर जोड़कर 1000x शेयर 1:10 के FDU aliquots पतला.
  2. प्रत्येक पकवान के बाहर की अंगूठी करने के लिए 20μl पतला FDU sol'n जोड़ें. विंदुक युक्तियाँ अक्सर बदलें. कवर और इनक्यूबेटर पर लौटने.

    * के रूप में अगले 7-10 दिनों के लिए संभव के रूप में छोटे व्यंजन डिस्टर्ब. संक्रमित व्यंजनों के लिए जाँच करें और संक्रमण का पहला संकेत पर किसी भी संक्रमित व्यंजन हटायें. संस्कृतियों 3 सप्ताह के भीतर परीक्षण के लिए तैयार हैं.

मीडिया समाधान /

Neuronal मध्यम

(200ml के लिए)

उत्तम ** यदि washes / trituration के लिए उपयोग करने से पहले रात भर बोतल से glia पर वातानुकूलित

घटक मात्रा नोट्स
5% BSA 0.5 ग्राम भिन्न वी
सदस्य तरल 94.0 मिलीलीटर सिग्मा
DMEM तरल 80.0 मिलीलीटर सिग्मा
एफ - 12 तरल 20.0 मिलीलीटर सिग्मा
ग्लूकोज 45% तरल 1.50 मिलीलीटर सिग्मा समाधान
Glutamine 200mm 0.5 मिलीलीटर Aliquotted सिग्मा समाधान
Diporzio सान्द्र. 2.0 मिलीलीटर सिग्मा समाधान
Catalase लिक्विड 0.1 मिलीलीटर
Kynurenic 0.5m एसिड 200μl 1N NaOH
एचसीएल 5N 50 μl

  1. 250m में सामग्री (BSA पिछले चला जाता है) का मिश्रणएल प्लास्टिक की बोतल.
  2. फ़िल्टर, लेबल, और सर्द.

Kynurenic एसिड
(परिवार कल्याण 189.2 =)
0.5m = 94.6mg/ml
200μl की बाँझ aliquots में: 8ml शेयर 756.8mgKA/8ml 1N NaOH और विंदुक



DiPorzio मीडिया

ए) DiPorzio सान्द्र. स्टॉक:

नीड कम्बाइन Alliquot
Additive विलायक ट्यूब मात्रा मिलीलीटर / मिलीलीटर ट्यूब सान्द्र. मात्रा # Aliq.
इंसुलिन 20mm एचसीएल (1) प्लास्टिक 250mg बोतल 10 1 25mg/ml 25mg 10
Transferrin हांक 500mg बोतल 5 1 100mg/ml 100mg 5
वतन हांक 70mg बोतल 14 1 5mg/ml 5mg 14
Putrescine हांक 50mg 3 0.12 20mg/ml 2.4mg 21
ना 2 3 एसईओ हांक 0.104mg 10 0.5 10μg/ml 5.2μg 20
T3 10mm NaOH 2mg 10 0.1 0.20mg/ml 0mg 100
प्रोजेस्टेरोन 100% EtOH गिलास 12.5mg 10 0.05 1.25mg/ml Pipet का प्रयोग करें
कोर्टिसोल 100% EtOH गिलास 20mg 10 0.02 / 2.00mg मिलीलीटर Pipet का प्रयोग करें

  1. 20mm एचसीएल = 41.5μl सान्द्र. HCl/25ml.
  2. 1mg/ml शेयर करें और 10ml के लिए 104μl जोड़ने.



बी) DiPorzio मीडिया शेयर:

Additive राशि (एमएल) राशि X2 (मिलीलीटर) अंतिम सान्द्र. μg मिलीलीटर / अंतिम सान्द्र. Molarity
प्रोजेस्टेरोन 0.05 0.1 0.06 200nM
कोर्टिसोल 0.02 0.04 0.04 125nM
हांक बीएसएस 6.21 12.42
इंसुलिन 1 2 25
ना 2 3 एसईओ 0.5 1 0.01 30nm
T3 0.1 0.2 0.02 30nm
वतन 1 2 5
Putrescine 0.12 0.24 2.4 15nm
Transferrin 1 2 100

  1. एक 15ml polyproylene बाँझ ट्यूब प्रयोग प्रोजेस्टेरोन और कोर्टिसोल जोड़ने के लिए. एक Aspirator pipet और वैक्यूम प्रयोग EtOH के वाष्पीकरण की गति: (एक 5ml आधा और आधा रास्ता जगह में बहुत सावधान ट्यूब जा रहा है EtOH तरल नहीं aspirate में नीचे टूटी हुई stripette उपयोग pipet Kimwipes के साथ जगह में सुरक्षित पकड़ो और फिर टिप ले आओ. नीचे 500μl ट्यूब के किनारे पर स्थित निशान.
  2. बाद में वे ऊपर के चार्ट पर दिखाई देते हैं क्रम में aliquots जोड़ें.
  3. इंसुलिन, जो sol'n बादल छाए रहेंगे बनाता है के अलावा के बाद, 1N NaOH के 20μl को जोड़ने के लिए पीएच बेअसर. Sol'n पीले से गुलाबी और तुरंत स्पष्ट करने के लिए जाना चाहिए. भी, transferrin के अलावा के बाद, तुरंत 1N NaOH के 20μl जोड़ने के लिए, पीएच तटस्थ और precipitates के गठन को रोकने.
  4. एक सीरम वैज्ञानिक और 5 aliquots (एक बैच) में pipet में विभाजित 10ml ड्रा.
  5. स्टोर @ -20 डिग्री सेल्सियस
  6. एक बार में दो बैचों कर सकते हैं.

हदबंदी मीडिया

ए papain (शीशी 1 के लिए) :

** चढ़ाना के सही विच्छेदन पहले दिन की तैयारी.

घटक राशि </ Strong> (नोट्स) अंतिम सान्द्र.
Cysteine ​​जल 7.8mL 1mm सिस्टीन
Papain (190μl * की बोतल के लिए भिन्न
44.0mg/ml)
20 इकाइयों / एमएल (400 इकाइयों कुल
sol'n के 20ml के मूल्य के लिए)
एच एंड बी सान्द्र. 2ml
Carbogen 95% O2 + 5% सीओ 2
एचसीएल 5N 10μl
0.5% Phenol लाल 20μl 0.001%
0.5m Kynurenate 10μl 0.5mm (1N NaOH)

  1. सिस्टीन पानी papain सबसे पहले जोड़ें.
  2. H & B सान्द्र, kynurenate, एचसीएल, और phenol लाल जोड़ें.
  3. हदबंदी शीशी में फ़िल्टर (के रूप में सेट अप दिशाओं में वर्णित) और carbogen से कनेक्ट.


बी एच एंड बी ध्यान लगाओ (5X की 100ml):

सामग्री मेगावाट Powder/50ml एच 2 हे सान्द्र. (एम) कम्बाइन (मिलीलीटर) अंतिम सान्द्र. (मिमी)
NaCl 58.44 11.699 ग्राम 4 14.5 116
KCl 74.56 3.728 ग्राम 1 2.7 5.4
3 NaHCO 84.01 4.2 छ 1 13 26
नाह 2 पीओ 4 * एच 2 हे 137.99 6.90 छ 1 1 2
4 MgSO 120.38 6.019 ग्राम 1 0.5 1
EDTA (ED2 - एसएस)
292 सिग्मा 5% (बनाने
5g/100ml स्टॉक)
0.134 0.३,७२२ 0.5
ग्लूकोज़ 180 45% सिग्मा 2.5 5 25
तृकां एच 2 हे 62.93

  1. शेयर समाधान से मात्रा का मिश्रण.
  2. 4ml aliquots में फूट डालो.
  3. सिस्टीन पानी papain जोड़ने के बाद विभाज्य जोड़ें.

सी. Cysteine ​​जल (157.5ml 1X):

सामग्री मेगावाट अवयव
पाउडर (मिलीग्राम)
एच 2 हे (मिलीलीटर) स्टॉक सान्द्र (मिमी) कम्बाइन (मिलीलीटर) अंतिम सान्द्र. (मिमी)
2 CaCl 147.2 736 10 500 0.6 1.9mM
Cysteine 121.7 (1.5) 24 20mm (0.02M) 10 1.27mm
(0.88)
टीसी पानी 146.9

  1. और 4 पर 0.5m CaCl2 के एक शेयर sol'n रखने ° C
  2. एक सिस्टीन के उपयोग sol'n और अन्य सामग्री के साथ गठबंधन
  3. 4 में 15.75 मिलीग्राम और दुकान के 10 aliquots में फूट डालो डिग्री सेल्सियस


GDNF तैयारी

  1. विभाज्य प्रस्तुत करने:
    1. बाँझ विआयनीकृत पानी के 2.4mL के साथ बाँझ, 5μg GDNF की lyophilized गोली भंग. इस GDNF sol'n = 2.08μg/mL की एकाग्रता.
    2. बाँझ cryovials में 76.9μl aliquots में 2.08μg/mL GDNF sol'n बांटो. शीशी प्रति यह = 160ng.
    3. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  2. संस्कृतियों के लिए इसके अलावा:
    1. हर 8 व्यंजन के लिए 1 विभाज्य पहले गला लें.
    2. 723.1μl neuronal मीडिया / विभाज्य जोड़ने के द्वारा विभाज्य पतला. यह 160ng/800μl GDNF की एक sol'n कर देगा.
    3. प्रत्येक पकवान में मध्यम एमएल प्रति 10ng GDNF के अंतिम एकाग्रता के लिए 2ml इस sol'n के 100μl जोड़ें.


FDU तैयारी

FDU - sol'n 1000x शेयर:

घटक मात्रा (नोट्स) अंतिम सान्द्र.
Uridine 247 मिलीग्राम 16.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर
5 - FDU (5 fluorodeoxyuridine) 100 मिलीग्राम (बोतल) 6.7 मिलीग्राम / मिलीलीटर
टीसी जल 15 मिलीलीटर

  1. 16.5 uridine मिलीग्राम / एमएल के 15 मिलीलीटर से अधिक एक छोटे से बनाओ.
  2. FDU की 100 मिलीग्राम की बोतल के लिए 15 मिलीलीटर uridine sol'n 6.7 मिलीग्राम / एमएल sol'n FDU.
  3. -20 डिग्री सेल्सियस में 200μl aliquots और फ्रीज में फूट डालो

उपयोग के लिए पतला:

  1. गैर neuronal कोशिकाओं के विकास को बाधित. 1.8 मिलीलीटर सदस्य 200μl शेयर जोड़कर 1000x शेयर 1:10 पतला.
  2. प्रत्येक पकवान के बाहर की अंगूठी करने के लिए 20μl पतला FDU जोड़ें. Pipet सुझावों अक्सर बदलें. कवर और इनक्यूबेटर पर लौटने.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ वर्णित तरीकों केंद्रीय dopamine न्यूरॉन्स कि एक प्रणालीगत या vivo दृष्टिकोण में अन्यथा उपलब्ध नहीं हैं morphological और neurochemical सुविधाओं का ठीक संकल्प के लिए अनुमति देते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

काम DK065872 (ENP), जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक स्मिथ परिवार उत्कृष्टता के फाउंडेशन पुरस्कार (ENP), F31 (बीएमजी, ENP) DA023760 और NS047243 p30 (तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के लिए Tufts केंद्र) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Materials are included in the protocol text.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
  2. Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
  3. Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
  4. Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
  5. Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).

Comments

29 Comments

  1. Excellent!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2008 - 11:03 AM
  2. I would like to thank Lauren and Emmanuel for such an excellent piece of science. I was thinking of setting up the method in my lab and the video encouraged me to do so. Sure it helps a lot!!! Hope to see more like this video in the future.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 13, 2009 - 11:59 AM
  3. Thank you very much for this wonderful protocol. I am very excited to try this out. Could you please let me know what kind of plates you used for plating the glia and where did you buy the slide rings from (catalog number perhaps). Thanks a bunch!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2009 - 4:38 PM
  4. Thank you for the comment and we are happy to help. The dishes were ordered from World Precision Instruments: FlouroDish FD35PDL-100, tissue culture dish with cover glass bottom, dish:35mm glass:²3mm. Thanks, Lauren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 11:20 AM
  5. And slide rings: Thomas 6705-R1² Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 1:57 PM
  6. can you please tell me how to separate astrocyte from neurons using serum coating. please send a protocol if possible. thanks Gaurav jain gauravjain_niper@yahoo.co.in

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:27 PM
  7. We do not have a protocol to separate astrocytes from neurons, all our cell sorting is done through immunocytochemistry on fixed tissue. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 24, 2009 - 3:21 PM
  8. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:18 AM
  9. Cortical astrocytes are the best option as the midbrain dŒs not provide as high a yield. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2009 - 7:44 AM
  10. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:28 AM
  11. Hi, the astrocytes we derive from cortical tissue (higher yield than in the midbrain).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:14 PM
  12. Hi there,

    It's great to find this info online, many thanks for submitting it. Can I ask what kind of % DA neuron yields you're getting this way?

    Cheers,

    Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 9:39 AM
  13. The yield is in the range of 40-60% if cells are plated in the presence of GDNF. Otherwise, the yield is in the range of 10-²0%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:17 PM
  14. Hi again,

    Sorry, i had one other thing to ask if I may. We have a lot of experience with hippocampal dissociated cultures and would be interested in seeing whether the midbrain cultures can work with the media we use for these (Neurobasal and variants); in trying this, is there any specific nutritional or medium requirement of DA neurons you've identified that we should be aware of, which isn't likely to be something we are already giving the hippocampal neurons? I see you include things like catalase and kynurenic acid that aren't in our medium......I presume these are to minimise oxidative and excitotoxic stress? Can i ask, do you have an idea of how much these improve the yield by? Many thanks again, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 10:36 AM
  15. As mentioned above, the single most critical factor in improving dopamine neuron yield is GDNF.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:19 PM
  16. Many thanks indeed for this information, that's really helpful. cheers,
    Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 4:46 PM
  17. Sorry, one final one from me - have you ever tried the Banker method with these? I have heard this dŒsn't work as well as having the cell layers in full contact, is this your experience? Is it very much worse? I am very interested in trying Banker because a neuronal monolayer would work much better with the microscopy set up I want to use! Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 19, 2010 - 4:59 AM
  18. No, we have not tried the Banker protocol on this.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2010 - 12:25 PM
  19. Hello, I wonder if I can ask what you coat your culture dishes with before plating astrocytes? I am finding that mouse glia may be quite sensitive to the usual things like poly-D-lysine etc. Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2010 - 9:01 AM
  20. Poly-D-lysine is fine for rat astrocytes, laminin is better for mouse astrocytes (although poly-D-lysine has also worked for us in mouse cultures).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 28, 2010 - 2:56 PM
  21. Hi, thanks for the protocol. Can you explain why you use P0-P² mice? I am looking to study early DA neurons from what would become the VTA and was planning on using embryonic brains, so wondered what the reason was for using neonatal brains here.

    Many thanks,
    Naomi

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 4, 2012 - 10:29 AM
  22. Using embryonic instead of neonatal brains with this procedure would be fine provided that you account for adequate brain development in utero. To be safe and ensure health of the dopamine cell bodies in culture, I would avoid using embryos prior to the third trimester of gestation. We have not used dissociated cultures for precursors to dopamine neurons so I am not really qualified to vouch for the viability of such preparations. Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 18, 2012 - 6:55 PM
  23. Ok, thank you!

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 19, 2012 - 4:20 AM
  24. Hi Naomi, the protocol should work with embryonic brains as well (provided you allow for development of DA neurons) but the dissection is going to be much more challenging. I would suggest you culture neurons from the midbrain (both VTA and nigra) in that case to allow for the difference in size of the brain sites you are targeting. MIcrodissection techniques may also help, but you have to find the way to get your tissue in carbogenated media ASAP.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:44 PM
  25. Thank you for posting such a great informational video. I have a follow-up question to the previous question on this page: would it also be appropriate to use postnatal day 2-5 mice instead of PN 0-2? I ask because I have seen other protocols to culture primary dopamine neurons that use older mice (for example, Smeyne and Smeyne, 2002).

    Thanks,
    Brittany W.

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    July 5, 2013 - 2:18 PM
  26. Hi Brittany, you can try with P2-P5 but it is not optimal. P0-P2 would typically give you the highest yield in live DA cells in culture, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:47 PM
  27. Thanks!

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    November 21, 2013 - 2:39 PM
  28. Hi, The protocol is explained and shown very nicely. I want to do only dopaminergic neuron culture. Is it possible to do the culture without glia or seeding it directly on poly d lysine coated plates. In your protocol you have added FDU to kill dividing cells (glia), does it kill all within and outside the ring in the plate, and you get only dopminergic cells at the end. Would you please help and suggest a bit. Thanks. Farah

    Reply
    Posted by: Farah S.
    November 20, 2013 - 10:27 AM
  29. Hi Farah, we have not been able to produce DA cell cultures without plating glia, the latter are needed to condition the media and help sustain the culture for several weeks. If you only think of acute experiments, it might be possible to isolate DA cells for a few hours, but they would have no neurites, they would be difficult to identify as DA neurons and they would die very fast. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:51 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics