Primaria dissociato mesencefalo colture cellulari dopamina da roditori neonati

Biology

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Summary

Primaria dissociato mesencefalo colture di cellule della dopamina permettono per lo studio delle caratteristiche presinaptici dei neuroni dopaminergici. Possono essere utilizzati per monitorare in tempo reale la cinetica di rilascio di dopamina e proteine ​​/ mRNA livelli di regolatori di esocitosi dopamina. Qui vi mostriamo come generare queste culture da neonati di roditori.

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Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates. J. Vis. Exp. (21), e820, doi:10.3791/820 (2008).

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Abstract

La possibilità di creare colture cellulari primarie di neuroni dopaminergici permette per lo studio delle caratteristiche presinaptici dei neuroni dopaminergici in isolamento da ingresso sistemica da altre parti del cervello. Nel nostro laboratorio, usiamo questi neuroni per valutare la cinetica di rilascio di dopamina amperometria utilizzando fibra di carbonio, così come i livelli di espressione di geni correlati dopamina e proteine ​​mediante PCR quantitativa e immunocitochimica. In questo video vi mostriamo come si generano queste culture da neonati di roditori.

Il processo prevede diverse fasi, tra cui la placcatura di corticale astrociti gliali, il condizionamento dei mezzi di coltura delle cellule neuronali del substrato gliale, la dissezione del mesencefalo nei neonati, la digestione, l'estrazione e la placcatura dei neuroni della dopamina e l'aggiunta di fattori neurotrofici per garantire la sopravvivenza delle cellule.

Le applicazioni adatte per tali preparati sono elettrofisiologia, immunocitochimica, PCR quantitativa, microscopia video (ad es, in tempo reale fusione vescicolare con la membrana plasmatica), saggi di vitalità cellulare e di altri schermi tossicologico.

Protocol

Preparazione precedente la Cultura

Nota: le cellule gliali ** deve essere placcato con largo anticipo in modo da avere il tempo di proliferare e coprire il fondo dei piatti. Per mouse con atipica o sperimentale background genetico, assicurarsi di corrispondere culture gliali e neuroni in termini di genotipo.

Nota: ** 1-7 giorni prima della dissezione, preparare fresca media neuronale e sostituire il supporto gliali nei piatti con 2 ml.

Note: ** Il giorno prima della dissezione, i seguenti elementi devono essere lasciati ai raggi UV durante la notte:

  • 4 piastre di dissezione
  • 2 flaconi dissociazione con un micro-magnetico ancoretta
  • 2 tappi flaconcino (con 2 piccoli fori infilò nella parte superiore)
  • Stendere anelli scorrimento (e cappotto in 70% EtOH) - lasciare la finestra aperta anche
  • ALMENO 2 scatole piene di colore giallo (10-200μl) puntali
  • 1 confezione di blu (100-1000μl) puntali

Giornata della Cultura

Nota: * Assicurarsi di non toccare nulla che è stato lasciato OUT PER UV NOTTE!

Mantenimento di un ambiente sterile sotto il cofano è molto importante.

1) Set Up:

Nota: ** Mettere da parte tutti gli ingredienti congelati per rendere soluzione papaina.

  1. Pinze pulite, con il 70% EtOH. Coprire ogni punta con una punta sterile pipetta gialla. Utilizzato per effettuare gli anelli scivolare sterili nella loro scatola.
  2. Placca di cottura:
    1. Posizionare un piatto mini-magnetic/hot sotto il cofano con un bicchiere pieno 1000ml a 500-600ml dH 2 O e un grande bar ancoretta magnetica.
    2. Inserire un disco di polistirolo nel bicchiere appena sopra il livello dell'acqua.
    3. Far scorrere il termometro in un piccolo foro nel disco di polistirolo. Quadrante di calore deve essere leggermente superiore al 2 (per una temperatura di 34 ° C) e mescolare il quadrante dovrebbe essere ~ 5-6.
  3. PBS:
    1. Preparare PBS sterile e riempire 15 provette sterili 15ml con 4-6 ml (essere sicuri di mantenere sterile
      tecnica).
    2. Posizionare i tubi e la bottiglia magazzino su ghiaccio accanto alla cappa.
  4. Carbogen:
    1. Rompere un stripette 5 ml a metà e spingerlo attraverso un tappo di gomma, quindi la punta del stripette si sporge la parte più larga del tappo.
    2. Posizionare il tappo in un pallone da 500 ml con 400-500ml dH 2 O (fine rotto stripette dovrebbe essere nei 2 dH O).
    3. Collegare un tubo per l'apertura laterale del pallone.
    4. Tagliare la punta fuori di un puntale giallo e collegare questo alla fine del tubo (con il lato tagliato rivolto verso l'esterno).

      Collegare il serbatoio CarboGen alla punta del stripette 5 ml.

  5. Preparare la papaina sol'n:
    1. * Utilizzare attenta tecnica sterile.
    2. Mescolare in una sterile tubo 50ml.
  6. Filtro papaina sol'n nel flaconcino dissociazione:
    1. Utilizzare una unità di filtrazione Steriflip e trasferimento in fiala dissociazione via 25ml stripette (OR posto un nuovo filtro siringa 0.2μm sulla punta di una siringa stantuffo 20ml,
      togliere lo stantuffo e utilizzare un stripette (25 ml) per trasferire tutti i sol'n papaina nella siringa.
    2. Filtro nel flacone dissociazione).
    3. Tappo del flacone, inserire una siringa sterile attraverso il foro nel tappo e porre un filtro siringa sterile 0.2μm alla base della siringa.
    4. Collegare il CarboGen al filtro e parafilm questo luogo in. Posizionare il flaconcino nel polistirolo disco / supporto.

      * Il micro-ancoretta magnetica deve essere in movimento.
      * Il gas DEVE essere rendendola nel flaconcino.
      * La temperatura deve stabilizzarsi a 34 ° C.

  7. Dissezione di preparazione:
    1. Portare il microscopio dissezione sotto il cofano.
    2. Disporre tutti gli strumenti di dissezione su lamina di alluminio, spruzzare con il 70% EtOH, versate in eccesso e lasciare sotto il cofano ad asciugare.
  8. Preparare media neuronale:
    1. Lascia 30ml di fresco media neuronale nell'incubatrice.
  9. Lay out 1 grande piazza di fogli di alluminio e 12 quadrati più piccoli. Lasciare le forbici decapitazione con il foglio di alluminio. Riempire una piccola scatola di polistirolo con acqua ghiacciata e lasciare tutto al di fuori della cappa.
  10. Prep l'anestesia (0.075ml ketamina e 0.075ml xzylazine).
  11. Ottenere almeno 12 cuccioli (P0-P2) per 100 piastre. Per i topi, assicurarsi che vi sia una corrispondenza genotipo per l'intera cucciolata. Se il genotipo non è noto, le cellule lastra da ogni cucciolo su un piatto a parte, registrando accuratamente le cifre del mouse e di abbinarle con i piatti di coltura cellulare e assicurarsi che il background genetico del substrato gliale è uniforme in colture cellulari.

2) La dissezione

  1. Anestetizzare il primo animale con un'iniezione intraperitoneale. Quando animale mostra sedazione e non risponde alla coda-flick test, metterlo in ghiaccio per 30 secondi (fino a ipotermia). Risciacquare un piccolo foglio di alluminio quadrata, Decapitation forbici, e la testa con il 70% EtOH.
  2. Decapitare, permettono testa a cadere sulla piazza foglio di alluminio e passare sotto il cofano. Rimuovere delicatamente il cervello in una provetta da 15 ml di PBS ghiacciato. Posizionare il tubo di ritorno sul ghiaccio durante la rimozione del cervello successivo.
  3. Ripetere questi primi passi fino a quando ci sono 3 cervelli sul ghiaccio. Versare tutti e 3 i cervelli e PBS sul piatto prima dissezione sotto il microscopio. Rimuovere sezione appropriata del cervello (VTA) e utilizzare una pipetta di trasferimento per mettere i segmenti in papaina sol'n. Avviare un timer quando i segmenti prima andare in
  4. Ripetere le precedenti 3 passi fino a quando tutti i cervelli vengono digeriti in papaina. Il tempo medio di digestione deve essere di 2 ore. I segmenti prima sono stati in per circa 1 ora per il momento gli ultimi entrare,

    Provate a dividere la differenza.

  5. * Durante la digestione:
    1. Assicurarsi che la temperatura nella vasca da bagno è di 34 ° C.
    2. Segmenti possono aderire al ancoretta in un primo momento, ma dovrebbe sparsi col passare del tempo. Se non lo fanno, toccare il fondo della fiala.

3) Triturazione:

  1. Con una pipetta di trasferimento, il trasferimento dei segmenti cervello in una provetta sterile 15 ml (cercare di evitare l'eccesso papaina sol'n) e lavarli 3 volte con 2 ml di medium gliali riscaldato dal termostato. Dopo aver messo i media gliali nel tubo, consentono segmenti di stabilirsi e poi rimuovere con attenzione il sol'n più possibile senza disturbare i segmenti. Cambia pipette per evitare l'inquinamento!

    ** NON TENERE il sol'n che viene rimosso.

  2. Con una pipetta fresca trasferimento iniziare triturazioni in 2 ml di media gliali. Triturare 25 volte (evitare di lasciare in bolle d'aria) e lasciare che il tubo di sedersi per 3 minuti fino a quando i segmenti non dissociato stabilirsi. Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere e TENERE sol'n il più possibile senza disturbare i segmenti in basso. Conservare il surnatante in un nuovo (sterile) tubo di 15m.
  3. Ripetere il passaggio precedente con una pipetta 1000μl e pipettare 200μl fino a completo dissociato.
  4. Triturare 10 volte con una pipetta di trasferimento, o fino a quando le cellule sono completamente risospeso in sol'n.

4) Placcatura Cellule

  1. Utilizzando una punta sterile pipetta gialla che copre ogni punta della pinza, con attenzione cadere un anello diapositiva come centrato al vetro nel miglior modo possibile all'interno di ogni piatto.
  2. Mettere 10μl della soluzione di cella sul emocitometro e contare. (Escludere masse spazzatura).
  3. Moltiplicare il numero di celle per 10. Questo è il numero di cellule / ml. Dividere 1,000,000-1,500,000 (o densità desiderata) da questo numero. Questo è il numero di microlitri per aggiungere al piatto.
  4. Utilizzare la punta della pipetta di scivolare gli anelli sul centro-bene di ogni piatto, come si aggiunge microlitri appropriato / piatto. Piastra delicatamente e passare suggerimenti per ogni piatto.
  5. Aggiungere 100μl (di diluito) sol'n GDNF all'interno dell'anello scivolo di ogni piatto.
  6. A questo punto, posto i vassoi nell'incubatrice e portare la media neuronale nella stanza fredda.
  7. Consentono alle cellule di riposare una notte.
  8. Giorno dopo: rimuovere gli anelli (con nuovi puntali sterili che copre le punte pinza per ogni piatto)

5) Inibizione mitotica: IL GIORNO SUCCESSIVO

  1. Diluire aliquote FDU di 1:10 magazzino 1000X con l'aggiunta di 200μl magazzino FDU a 1,8 ml di MEM sterile.
  2. Aggiungere 20μl diluito FDU sol'n all'anello esterno di ogni piatto. Cambia puntali spesso. Coprire e tornare alla incubatrice.

    * I piatti disturbare il meno possibile per i prossimi giorni 7-10. Verificare la presenza di piatti infetto e rimuovere eventuali piatti infette ai primi segni di infezione. Le culture sono pronti per i test entro 3 settimane.

MEDIA / SOLUZIONI

Media neuronale

(Per 200 ml)

** Meglio se condizione che glia da palloni durante la notte prima di utilizzarlo per lavaggi / triturazione

Ingrediente Quantità Note
BSA al 5% 0,5 g Frazione V
MEM liquido 94,0 ml Sigma
DMEM liquido 80,0 ml Sigma
F-12 liquido 20,0 ml Sigma
Glucosio liquido 45% 1,50 ml Sigma soluzione
Glutammina 200mm 0,5 ml Aliquotted Sigma soluzione
Diporzio Conc. 2,0 ml Sigma soluzione
Liquido Catalase 0,1 ml
Acido Kynurenic 0.5M 200μl In NaOH 1N
HCL 5N 50 microlitri

  1. Unire gli ingredienti (BSA va scorso) in una 250ml bottiglia di plastica.
  2. Filtro, etichetta, e conservare in frigorifero.

Acido Kynurenic
(FW = 189,2)
0.5M = 94.6mg/ml
Fai 8ml magazzino: 756.8mgKA/8ml 1N NaOH e pipettare in aliquote STERILE di 200μl



DiPorzio media

A) Conc. DiPorzio. Azioni:

BISOGNO Combinare Alliquot
Additivo Solvente Tubo Quantità ml ml / tubo Conc. Quantità # Aliq.
Insulina 20 mM HCL (1) plastica Bottiglia 250mg 10 1 25mg/ml 25mg 10
Transferrina Hank Bottiglia 500mg 5 1 100mg/ml 100mg 5
SOD Hank Bottiglia 70mg 14 1 5mg/ml 5mg 14
Putrescina Hank 50mg 3 0,12 20mg/ml 2.4mg 21
Na 2 SeO 3 Hank 0.104mg 10 0,5 10μg/ml 5.2μg 20
T3 NaOH 10mM 2mg 10 0,1 0.20mg/ml 0mg 100
Progesterone 100% EtOH Vetro 12.5mg 10 0,05 1.25mg/ml Usa pipetta
Cortisolo 100% EtOH Vetro 20mg 10 0,02 2.00mg / ml Usa pipetta

  1. 20 mM HCl = 41.5μl conc. HCl/25ml.
  2. Fai magazzino 1mg/ml e aggiungere 104μl di 10ml.



B) DiPorzio di supporto di stampa:

Additivo Quantità (ml) Quantità (ml) X2 Conc. finale. mcg / ml Conc. finale. Molarità
Progesterone 0,05 0,1 0,06 200nm
Cortisolo 0,02 0,04 0,04 125nM
Hank BSS 6,21 12,42
Insulina 1 2 25
Na 2 SeO 3 0,5 1 0,01 30nm
T3 0,1 0,2 0,02 30nm
SOD 1 2 5
Putrescina 0,12 0,24 2,4 15Nm
Transferrina 1 2 100

  1. Utilizzare un tubo in polipropilene da 15 ml sterile per aggiungere il progesterone e cortisolo. Utilizzare una pipetta aspiratore ed il vuoto a velocità di evaporazione di EtOH: (utilizzare un stripette 5ml spezzato a metà e posto a metà strada giù nel tubo facendo molta attenzione a non aspirare il liquido EtOH pipetta Tenere saldamente in posizione con Kimwipes e poi portare la punta. verso il marchio 500μl situato sul lato del tubo.
  2. Aggiungere le aliquote successive nell'ordine in cui appaiono sul grafico di cui sopra.
  3. Dopo l'aggiunta di insulina, che rende la nuvoloso sol'n, aggiungere 20μl di 1N NaOH per neutralizzare il pH. Sol'n dovrebbe andare dal giallo al rosa e subito chiaro. INOLTRE, dopo l'aggiunta di transferrina, subito aggiungere 20μl di NaOH 1N, per neutralizzare il pH e prevenire la formazione di precipitati.
  4. Elaborare 10ml in una pipetta sierologica e dividere in 5 aliquote (una partita).
  5. Conservare @ -20 ° C.
  6. Possono fare 2 partite in una sola volta.

Dissociazione media

A. papaina (per 1 fiala):

** Preparare giorno della placcatura a destra prima di dissezione.

Ingrediente Importo </ Strong> (Note) Conc. finale.
Cisteina acqua 7.8mL 1 mM cisteina
Papaina Varia (* 190μl per la bottiglia di
44.0mg/ml)
20 unità / ml (400 unità totali
per un valore di sol'n 20ml)
H & B conc. 2 ml
Carbogen 95% O2 + 5% di CO2
HCl 5N 10μl
0,5% rosso fenolo 20μl 0,001%
Kynurenate 0.5M 10μl (In 1N NaOH) 0,5 mm

  1. Aggiungi papaina all'acqua cisteina PRIMO.
  2. Aggiungere il H & B conc., Kynurenate, HCl, e il rosso fenolo.
  3. Filtro nella fiala dissociazione (come descritto nel set-up le direzioni) e connettersi al CarboGen.


B. H & B Concentrato (100 ml di 5X):

Ingredienti MW Powder/50ml H 2 O Conc. (M) Combina (ml) Conc. finale. (MM)
NaCl 58,44 11,699 g 4 14,5 116
KCl 74,56 3,728 g 1 2,7 5,4
NaHCO 3 84,01 4,2 g 1 13 26
NaH 2 PO 4 * H 2 O 137,99 6,90 g 1 1 2
MgSO 4 120,38 6,019 g 1 0,5 1
EDTA (ED2-SS)
292 Sigma 5% (fare
5g/100ml stock)
0,134 0,3722 0,5
Glucosio 180 Sigma 45% 2,5 5 25
TC H 2 O 62,93

  1. Combina somme da soluzioni di riserva.
  2. Dividere in aliquote 4ml.
  3. Aggiungi aliquota all'acqua cisteina dopo l'aggiunta di papaina.

C. L'acqua cisteina (157.5ml di 1X):

Ingredienti MW Componenti
Polvere (mg)
H 2 O (ml) Conc. magazzino. (MM) Combina (ml) Conc. finale. (MM)
CaCl 2 147,2 736 10 500 0,6 1.9mm
Cisteina 121,7 (1.5) 24 20mm (0.02M) 10 1,27 mm
(0.88)
TC acqua 146,9

  1. Fare e mantenere un sol'n stock di CaCl2 0,5 M a 4 ° C
  2. Fai una sol'n uso di cisteina e combinare con altri ingredienti
  3. Dividere in aliquote da 10 ml di 15,75 e conservare a 4 ° C


GDNF Preparazione

  1. Aliquota di preparazione:
    1. Sciogliere sterile, pastiglia liofilizzata di 5μg GDNF con 2,4 ml di acqua deionizzata sterile. La concentrazione di questo sol'n GDNF = 2.08μg/mL.
    2. Distribuire il 2.08μg/mL GDNF sol'n in 76.9μl aliquote in cryovials sterile. Questo 160ng = per flaconcino.
    3. Conservare a -20 ° C.
  2. Oltre alle culture:
    1. Scongelare 1 aliquota per ogni 8 piatti.
    2. Diluire un'aliquota aggiungendo 723.1μl mezzi neuronale / aliquota. Questo farà una sol'n di 160ng/800μl GDNF.
    3. Aggiungere 100μl di questo sol'n al 2 ml di mezzo in ogni piatto per una concentrazione finale di 10ng GDNF per ml.


FDU Preparazione

FDU-sol'n archivi 1000X:

Ingrediente Quantità (Note) Conc. finale.
Uridina 247 mg 16,5 mg / ml
5-FDU (5-fluorodeoxyuridine) 100 mg (bottiglia) 6,7 mg / ml
TC acqua 15 ml

  1. Fai un po 'più di 15 ml di 16,5 mg / ml uridina.
  2. Aggiungere 15 ml uridina sol'n a 100 mg di bottiglia FDU per fare 6,7 mg / ml sol'n FDU.
  3. Dividere in aliquote da 200μl e congelare a -20 ° C.

Diluire per l'uso:

  1. Inibire la crescita di cellule non neuronali. Diluire 1:10 magazzino 1000X con l'aggiunta di magazzino 200μl a 1,8 ml di MEM.
  2. Aggiungere 20μl FDU diluito per l'anello al di fuori di ogni piatto. Cambia puntali spesso. Coprire e tornare alla incubatrice.

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Discussion

I metodi descritti permettono di risoluzione fine delle caratteristiche morfologiche e neurochimica dei neuroni dopaminergici centrali che non sono altrimenti disponibili in un approccio sistemico o in vivo.

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Acknowledgements

Il lavoro è stato supportato da DK065872 (PEV), una famiglia Smith Award Foundation di eccellenza nella ricerca biomedica (PEV), F31 DA023760 (BMG, PEV) e P30 NS047243 (Tufts Center for Neuroscience Research).

Materials

Materials are included in the protocol text.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
  2. Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
  3. Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
  4. Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
  5. Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).

Comments

29 Comments

  1. Excellent!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2008 - 11:03 AM
  2. I would like to thank Lauren and Emmanuel for such an excellent piece of science. I was thinking of setting up the method in my lab and the video encouraged me to do so. Sure it helps a lot!!! Hope to see more like this video in the future.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 13, 2009 - 11:59 AM
  3. Thank you very much for this wonderful protocol. I am very excited to try this out. Could you please let me know what kind of plates you used for plating the glia and where did you buy the slide rings from (catalog number perhaps). Thanks a bunch!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2009 - 4:38 PM
  4. Thank you for the comment and we are happy to help. The dishes were ordered from World Precision Instruments: FlouroDish FD35PDL-100, tissue culture dish with cover glass bottom, dish:35mm glass:²3mm. Thanks, Lauren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 11:20 AM
  5. And slide rings: Thomas 6705-R1² Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 1:57 PM
  6. can you please tell me how to separate astrocyte from neurons using serum coating. please send a protocol if possible. thanks Gaurav jain gauravjain_niper@yahoo.co.in

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:27 PM
  7. We do not have a protocol to separate astrocytes from neurons, all our cell sorting is done through immunocytochemistry on fixed tissue. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 24, 2009 - 3:21 PM
  8. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:18 AM
  9. Cortical astrocytes are the best option as the midbrain dŒs not provide as high a yield. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2009 - 7:44 AM
  10. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:28 AM
  11. Hi, the astrocytes we derive from cortical tissue (higher yield than in the midbrain).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:14 PM
  12. Hi there,

    It's great to find this info online, many thanks for submitting it. Can I ask what kind of % DA neuron yields you're getting this way?

    Cheers,

    Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 9:39 AM
  13. The yield is in the range of 40-60% if cells are plated in the presence of GDNF. Otherwise, the yield is in the range of 10-²0%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:17 PM
  14. Hi again,

    Sorry, i had one other thing to ask if I may. We have a lot of experience with hippocampal dissociated cultures and would be interested in seeing whether the midbrain cultures can work with the media we use for these (Neurobasal and variants); in trying this, is there any specific nutritional or medium requirement of DA neurons you've identified that we should be aware of, which isn't likely to be something we are already giving the hippocampal neurons? I see you include things like catalase and kynurenic acid that aren't in our medium......I presume these are to minimise oxidative and excitotoxic stress? Can i ask, do you have an idea of how much these improve the yield by? Many thanks again, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 10:36 AM
  15. As mentioned above, the single most critical factor in improving dopamine neuron yield is GDNF.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:19 PM
  16. Many thanks indeed for this information, that's really helpful. cheers,
    Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 4:46 PM
  17. Sorry, one final one from me - have you ever tried the Banker method with these? I have heard this dŒsn't work as well as having the cell layers in full contact, is this your experience? Is it very much worse? I am very interested in trying Banker because a neuronal monolayer would work much better with the microscopy set up I want to use! Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 19, 2010 - 4:59 AM
  18. No, we have not tried the Banker protocol on this.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2010 - 12:25 PM
  19. Hello, I wonder if I can ask what you coat your culture dishes with before plating astrocytes? I am finding that mouse glia may be quite sensitive to the usual things like poly-D-lysine etc. Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2010 - 9:01 AM
  20. Poly-D-lysine is fine for rat astrocytes, laminin is better for mouse astrocytes (although poly-D-lysine has also worked for us in mouse cultures).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 28, 2010 - 2:56 PM
  21. Hi, thanks for the protocol. Can you explain why you use P0-P² mice? I am looking to study early DA neurons from what would become the VTA and was planning on using embryonic brains, so wondered what the reason was for using neonatal brains here.

    Many thanks,
    Naomi

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 4, 2012 - 10:29 AM
  22. Using embryonic instead of neonatal brains with this procedure would be fine provided that you account for adequate brain development in utero. To be safe and ensure health of the dopamine cell bodies in culture, I would avoid using embryos prior to the third trimester of gestation. We have not used dissociated cultures for precursors to dopamine neurons so I am not really qualified to vouch for the viability of such preparations. Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 18, 2012 - 6:55 PM
  23. Ok, thank you!

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 19, 2012 - 4:20 AM
  24. Hi Naomi, the protocol should work with embryonic brains as well (provided you allow for development of DA neurons) but the dissection is going to be much more challenging. I would suggest you culture neurons from the midbrain (both VTA and nigra) in that case to allow for the difference in size of the brain sites you are targeting. MIcrodissection techniques may also help, but you have to find the way to get your tissue in carbogenated media ASAP.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:44 PM
  25. Thank you for posting such a great informational video. I have a follow-up question to the previous question on this page: would it also be appropriate to use postnatal day 2-5 mice instead of PN 0-2? I ask because I have seen other protocols to culture primary dopamine neurons that use older mice (for example, Smeyne and Smeyne, 2002).

    Thanks,
    Brittany W.

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    July 5, 2013 - 2:18 PM
  26. Hi Brittany, you can try with P2-P5 but it is not optimal. P0-P2 would typically give you the highest yield in live DA cells in culture, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:47 PM
  27. Thanks!

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    November 21, 2013 - 2:39 PM
  28. Hi, The protocol is explained and shown very nicely. I want to do only dopaminergic neuron culture. Is it possible to do the culture without glia or seeding it directly on poly d lysine coated plates. In your protocol you have added FDU to kill dividing cells (glia), does it kill all within and outside the ring in the plate, and you get only dopminergic cells at the end. Would you please help and suggest a bit. Thanks. Farah

    Reply
    Posted by: Farah S.
    November 20, 2013 - 10:27 AM
  29. Hi Farah, we have not been able to produce DA cell cultures without plating glia, the latter are needed to condition the media and help sustain the culture for several weeks. If you only think of acute experiments, it might be possible to isolate DA cells for a few hours, but they would have no neurites, they would be difficult to identify as DA neurons and they would die very fast. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:51 PM

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