Primär dissocierade mitthjärnan Dopamin cellkulturer från Gnagare Nyfödda

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Primär dissocierade mitthjärnan dopamin cellkulturer möjliggöra studier av presynaptiska egenskaper dopaminneuron. De kan användas för att övervaka i realtid kinetik dopaminfrisättning och protein / mRNA nivåer av regulatorer av dopamin exocytos. Här visar vi hur du skapar dessa kulturer från gnagare nyfödda.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates. J. Vis. Exp. (21), e820, doi:10.3791/820 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Möjligheten att skapa primära cellkulturer av dopaminneuron möjliggör studier av presynaptiska egenskaper dopaminneuron isolerat från systemisk input från andra håll i hjärnan. I vårt labb använder vi dessa nervceller att bedöma dopaminfrisättning kinetik med amperometry kolfiber, liksom nivåerna uttryck av dopamin relaterade gener och proteiner med hjälp av kvantitativ PCR och immuncytokemi. I denna video visar vi hur vi skapar dessa kulturer från gnagare nyfödda.

I processen ingår flera steg, bland annat plätering av kortikal gliaceller astrocyter, konditionering av neuronala medier cellkulturer av gliaceller substratet, dissektion av mellanhjärnan hos nyfödda, matsmältningen, utvinning och plätering av dopamin neuroner och tillägg av neurotrofa faktorer se cellöverlevnad.

Det program lämpade för en sådan beredning inkluderar elektrofysiologi, immuncytokemi, kvantitativ PCR, video mikroskopi (dvs i realtid SVD fusion med plasmamembranet), cell-analyser livskraft och andra toxikologiska skärmar.

Protocol

Förberedelser före Kultur

Obs: ** Gliaceller måste klädd i god tid så att de har tid att föröka sig och täcka botten av rätter. För möss med atypiska eller experimentella genetisk bakgrund, se till att matcha gliaceller och nervceller kulturer i termer av genotyp.

Obs: ** 1-7 dagar före dissekering, bered nya neuronala medium och ersätta gliaceller mediet i rätter med 2ml.

Obs: ** På dagen före dissekering följande produkter måste lämnas under UV-ljus över natten:

  • 4 dissektion plattor
  • 2 dissociation injektionsflaskor med en mikro-magnetisk omrörare
  • 2 flaska kapsyler (med 2 små hål petade i topp)
  • Sprid ut slide ringar (och kappa i 70% EtOH) - lämna rutan öppen även
  • MINST 2 hela kartonger med gul (10-200μl) pipettspetsar
  • 1 låda med blå (100-1000μl) pipettspetsar

Dag för kultur

Anmärkning: * Se till att inte röra något som fanns kvar UT FÖR UV över en natt!

Att upprätthålla en steril miljö under huven är mycket viktigt.

1) Ställ upp:

Obs: ** Avsätt alla frysta ingredienser för att göra papain lösning.

  1. Rengör pincett med 70% EtOH. Täck varje spets med en steril gul pipettspetsen. Används för att placera sterila glida ringar i sin låda.
  2. Värmeplatta:
    1. Placera en mini-magnetic/hot plattan under huven med en 1000ml bägare fylld till 500-600ml dH 2 O och en stor magnetisk omrörare.
    2. Placera en frigolit skiva i bägaren precis ovanför vattenytan.
    3. Skjut termometern i ett litet hål i frigolit disken. Värme ratten behöver något över 2 (för en temp på 34 ° C) och rör om ratten borde ~ 5-6.
  3. PBS:
    1. Förbered sterila PBS och fyller 15 sterila 15 ml rör med 4-6 ml (se till att behålla steril
      teknik).
    2. Placera rören och beståndet flaskan på is intill huven.
  4. Carbogen:
    1. Bryt en 5ml stripette på mitten och pressa den genom en gummipropp, så spetsen på stripette sticker ut den breda änden av proppen.
    2. Placera proppen i en 500 ml kolv med 400-500ml dH 2 O (bruten slutet av stripette bör vara i dH 2 O).
    3. Anslut ett rör på sidan öppnandet av kolven.
    4. Skär av spetsen en gul pipettspets och anslut den till slutet av röret (med den skurna sidan vänd utåt).

      Anslut carbogen tanken till toppen av 5ml stripette.

  5. Förbered papain sol'n:
    1. * Använd försiktig steril teknik.
    2. Blanda i ett sterilt 50 ml rör.
  6. Filtrera papain sol'n i dissociation flaskan:
    1. Använd en enhet Steriflip filtrering och överföring till dissociation flaskan via 25ml stripette (eller den plats ett nytt 0.2μm spruta filter på toppen av en 20ml kolv spruta,
      Ta ut kolven och använda en stripette (25 ml) att överlåta samtliga papain sol'n i sprutan.
    2. Filtret i dissociation flaskan).
    3. Cap flaskan, sätt in en steril spruta genom hålet i locket och bifoga en steril 0.2μm sprutfilter till basen på sprutan.
    4. Anslut carbogen till filtret och parafilm detta på plats. Placera injektionsflaskan i frigolit skiva / innehavaren.

      * Den mikro-magnetisk omrörare måste flytta.
      * Gasen skall vara att göra den i flaskan.
      * Temperaturen måste stabiliseras vid 34 ° C.

  7. Dissection prep:
    1. Ta med dissektion mikroskop under huven.
    2. Lägg ut alla dissektion instrument på aluminiumfolie, spraya med 70% EtOH, häll av överflödigt och lämna under huven för att torka.
  8. Förbered neuronala medium:
    1. Lämna 30ml av färska neuronala mediet i inkubatorn.
  9. Lägg ut en stor fyrkant av aluminiumfolie och 12 mindre rutor. Lämna halshuggning sax med aluminiumfolie. Fyll en liten frigolitlåda med is vatten och låt hela utsidan av rampen.
  10. Prep anestesi (0.075ml ketamin och 0.075ml xzylazine).
  11. Få minst 12 valpar (P0-P2) för 100 tallrikar. För möss, se till att det finns en genotyp match för hela kullen. Om genotyp är okänd, platta celler från varje valp på en separat skål, föra noggranna register över mus nummer och matcha dem med rätter cellodling och se till att den genetiska bakgrunden till gliaceller underlaget är enhetligt i cellkulturer.

2) Dissection

  1. Bedöva det första djuret med en intraperitoneal injektion. När djuret visar sedering och svarar inte på tail-flick test, lägga den i isen i 30 sekunder (tills hypotermi). Skölj ett litet torg aluminiumfolie, Decapitation sax och huvud med 70% EtOH.
  2. Halshugga, låt huvudet falla på aluminiumfolie torget och flytta under huven. Ta försiktigt bort hjärnan till en 15ml tub iskall PBS. Placera röret tillbaka på isen och ta av nästa hjärnan.
  3. Upprepa de första stegen tills det är 3 hjärnor på is. Häll alla 3 hjärnor och PBS på den första dissektion skålen under mikroskop. Ta lämpligt avsnitt av hjärnan (VTA) och göra en överföring pipett att sätta segmenten i papain sol'n. Starta en timer när de första segmenten gå in
  4. Upprepa föregående tre steg tills alla hjärnor är under rötas i papain. Den genomsnittliga tiden för matsmältningen ska vara 2 timmar. De första segmenten kommer att ha i ca 1 timme med den tid de sista gå in

    Försök att dela skillnaden.

  5. * Under matsmältning:
    1. Se till att temp i badet är 34 ° C.
    2. Segment kan hålla sig till de omrörare i början, men bör spridas ut med tiden. Om de inte gör, peka på botten av flaskan.

3) Trituration:

  1. Med hjälp av en pipett hjärnan segmenten till en steril 15 ml rör (försök att undvika överskott papain sol'n) och tvätta dem 3 gånger med 2 ml värmde gliaceller medium från inkubatorn. Efter att sätta gliaceller medierna i röret, låt segment för att bosätta sig och sedan försiktigt bort så mycket sol'n som möjligt utan att störa segment. Byt pipetter för att undvika kontaminering!

    ** Förvara inte de sol'n som tas bort.

  2. Med hjälp av en ny överföringspipett börja trituration i 2 ml av stödjeceller medier. Mal sönder 25 gånger (undvika att släppa in luftbubblor) och låt röret sitta i 3 minuter tills odissocierad segment lösa. Använd en överföringspipett att ta bort och behålla så mycket sol'n som möjligt utan att störa segment längst ner. Förvara supernatanten i en ny (steril) 15m rör.
  3. Upprepa föregående steg med hjälp av en 1000μl pipett och 200μl pipett tills helt dissocierade.
  4. Mal sönder 10 gånger med en överföringspipett, eller tills cellerna är helt återsuspenderade i sol'n.

4) Plating celler

  1. Använd en steril gul pipettspets täcker varje toppen av pincett, försiktigt släppa en bild ring som centrerad till glaset så bra som möjligt inom varje maträtt.
  2. Sätt 10μl av cellen lösningen på hemacytometer och räkna. (Exkludera skräp massorna).
  3. Multiplicera antalet celler med 10. Detta är antalet celler / mikroliter. Dela 1,000,000-1,500,000 (eller önskad densitet) med detta nummer. Detta är antalet l att lägga per maträtt.
  4. Använd pipettspetsen att glida ringar över centrum brunnar av varje maträtt som du lägger till lämplig l / maträtt. Plate dem försiktigt och byta tips för varje maträtt.
  5. Tillsätt 100μl (efter utspädning) GDNF sol'n inuti bilden ring av varje rätt.
  6. Vid denna tid, plats facken i inkubatorn och föra neuronala mediet i kylrum.
  7. Låt celler till sig under natten.
  8. Nästa dag: ta bort ringarna (med hjälp av ny steril pipettspetsar täcker pincett tips för varje maträtt)

5) mitotiskt Hämning: nästa dag

  1. Späd FDU alikvoter av 1000X lager 1:10 genom att lägga 200μl FDU lager till 1,8 ml steril MEM.
  2. Lägg 20μl utspädd FDU sol'n på utsidan ringen av varje rätt. Byt pipettspetsar ofta. Täck över och återgå till inkubatorn.

    * Stör disken så lite som möjligt för de kommande 7-10 dagar. Kontrollera om det smittade rätter och ta bort alla infekterade rätter vid första tecken på infektion. Kulturer är redo för testning inom 3 veckor.

Media / lösningar

Neuronal Medium

(För 200ml)

** Bästa om förutsättning av Glia från flaskor natten innan användning för tvättar / trituration

Ingrediens Belopp Anteckningar
BSA 5% 0,5 g Bråk V
MEM flytande 94,0 ml Sigma
DMEM flytande 80,0 ml Sigma
F-12 flytande 20,0 ml Sigma
Glukos 45% flytande 1,50 ml Sigma lösning
Glutamin 200mm 0,5 ml Aliquotted Sigma lösning
Diporzio Konc. 2,0 ml Sigma lösning
Flytande Catalase 0,1 ml
Kynurensyra 0,5 M 200μl I 1N NaOH
HCL 5N 50 l

  1. Kombinera ingredienser (BSA går sista) i en 250ml plastflaska.
  2. Filter, märkning och kyla.

Kynurensyra
(FW = 189,2)
0,5 M = 94.6mg/ml
Gör 8ml lager: 756.8mgKA/8ml 1N NaOH och pipett till sterila alikvoter av 200μl



DiPorzio Media

A) DiPorzio Konc. Aktier:

BEHOV Kombinera Alliquot
Tillsats Lösningsmedel Tube Belopp ml ml / rör Konc. Belopp # Aliq.
Insulin 20mm HCL (1) plast 250mg flaska 10 1 25mg/ml 25mg 10
Transferrin Hanks 500mg flaska 5 1 100mg/ml 100mg 5
TORVTÄCKA Hanks 70 mg flaska 14 1 5mg/ml 5 mg 14
Putrescine Hanks 50 mg 3 0,12 20mg/ml 2.4mg 21
Na 2 Seo 3 Hanks 0.104mg 10 0,5 10μg/ml 5.2μg 20
T3 10 mM NaOH 2mg 10 0,1 0.20mg/ml 0mg 100
Progesteron 100% EtOH Glas 12,5 10 0,05 1.25mg/ml Använd pipett
Kortisol 100% EtOH Glas 20mg 10 0,02 2.00mg / ml Använd pipett

  1. 20mm HCl = 41.5μl konc. HCl/25ml.
  2. Gör 1mg/ml lager och lägga 104μl till 10ml.



B) DiPorzio Media Lager:

Tillsats Belopp (ml) Mängden (ML) X2 Final Konc. mikrogram / ​​ml Final Konc. Molaritet
Progesteron 0,05 0,1 0,06 200Nm
Kortisol 0,02 0,04 0,04 125nM
Hank är BSS 6,21 12,42
Insulin 1 2 25
Na 2 Seo 3 0,5 1 0,01 30nm
T3 0,1 0,2 0,02 30nm
TORVTÄCKA 1 2 5
Putrescine 0,12 0,24 2,4 15Nm
Transferrin 1 2 100

  1. Använd en 15ml polyproylene sterilt rör för att lägga till progesteron och kortisol. Använd en aspirator pipett och vakuum för att snabba avdunstning av EtOH: (använd en 5ml stripette bruten i två halvor och placera halvvägs ner i röret är mycket noga med att inte aspirera EtOH flytande Håll pipett säkert på plats med Kimwipes och sedan föra spetsen. ner till 500μl märket sitter på sidan av röret.
  2. Lägg till den efterföljande delprover i den ordning de visas på tabellen ovan.
  3. Efter tillsats av insulin, vilket gör sol'n molnigt, lägga 20μl av 1N NaOH för att neutralisera pH-värdet. Sol'n bör gå från gult till rosa och omedelbart klart. Också, efter tillägg av transferrin omedelbart lägga 20μl av 1N NaOH, för att neutralisera pH och förhindra bildandet av utfällningar.
  4. Gör upp 10ml i en serologisk pipett och dela i 5 alikvoter (ett parti).
  5. Förvara @ -20 ° C.
  6. Kan göra två satser på en gång.

Dissociation Media

A. Papain (för en flaska):

** Förbered dagen plätering precis före dissekering.

Ingrediens Belopp </ Strong> (Notes) Slutlig Konc.
Cystein Vatten 7.8mL 1mm cystein
Papain Varierar (* 190μl för flaska
44.0mg/ml)
20 enheter / ml (400 enheter totalt
för 20ml värde av sol'n)
H & B konc. 2ml
Carbogen 95% O2 + 5% CO2
HCl 5N 10μl
0,5% Fenolrött 20μl 0,001%
Kynurenate 0,5 M 10μl (I 1N NaOH) 0,5 mm

  1. Lägg papain till cystein vattnet först.
  2. Lägg till H & B konc., Kynurenate, HCl, och fenol rött.
  3. Filtrera i dissociation injektionsflaska (som beskrivs i set-up riktningar) och ansluta till carbogen.


B. H & B koncentrat (100 ml 5X):

Ingredienser MW Powder/50ml H 2 O Konc. (M) Kombinera (ml) Final Konc. (MM)
NaCl 58,44 11,699 g 4 14,5 116
KCl 74,56 3,728 g 1 2,7 5,4
NaHCO 3 84,01 4,2 g 1 13 26
NaH 2 PO 4 * H 2 O 137,99 6,90 g 1 1 2
MgSO 4 120,38 6,019 g 1 0,5 1
EDTA (Ed2-SS)
292 Sigma 5% (se
5g/100ml lump)
0,134 0,3722 0,5
Glukos 180 Sigma 45% 2,5 5 25
TC H 2 O 62,93

  1. Kombinera belopp från stamlösningar.
  2. Dela upp i 4 ml alikvoter.
  3. Lägg alikvot till cystein vatten efter att du lagt papain.

C. Cystein Vatten (157.5ml 1X):

Ingredienser MW Komponenter
Pulver (mg)
H 2 O (ml) Stock Konc. (Mm) Kombinera (ml) Final Konc. (MM)
CaCl 2 147,2 736 10 500 0,6 1.9mm
Cystein 121,7 (1.5) 24 20mm (0.02M) 10 1.27mm
(0.88)
TC vatten 146,9

  1. Ingå och hålla ett lager sol'n av 0,5 M CaCl2 vid 4 ° C
  2. Gör en en användning sol'n av cystein och kombinera med andra ingredienser
  3. Dela i 10 alikvoter av 15,75 ml och förvara vid 4 ° C


GDNF Förberedelser

  1. Alikvotera prep:
    1. Lös steril, frystorkad pellet av 5 mikrogram GDNF med 2,4 ml sterilt avjoniserat vatten. Koncentrationen av denna GDNF sol'n = 2.08μg/mL.
    2. Fördela 2.08μg/mL GDNF sol'n i 76.9μl alikvoter i sterila cryovials. Detta = 160ng per injektionsflaska.
    3. Förvara vid -20 ° C.
  2. Tillägg till kulturer:
    1. Tina en delmängd för varje 8 rätter.
    2. Späd alikvot genom att lägga 723.1μl neuronala media / delmängd. Detta kommer att göra en sol'n av 160ng/800μl GDNF.
    3. Tillsätt 100μl denna sol'n till 2 ml av mediet i varje rätt till en slutlig koncentration av 10 ng GDNF per ml.


FDU Förberedelser

FDU-sol'n 1000X lager:

Ingrediens Belopp (Notes) Slutlig Konc.
Uridin 247 mg 16,5 mg / ml
5-FDU (5-fluorodeoxyuridine) 100 mg (flaska) 6,7 mg / ml
TC Vatten 15 ml

  1. Gör lite över 15 ml 16,5 mg / ml uridin.
  2. Tillsätt 15 ml uridin sol'n till 100 mg flaska FDU att 6,7 mg / ml sol'n FDU.
  3. Dela i 200μl portioner och frysa i -20 ° C.

Späd för användning:

  1. Hämma tillväxten av icke-neuronala celler. Späd 1000X lager 1:10 genom att lägga till 200μl lager till 1,8 ml MEM.
  2. Lägg 20μl utspädd FDU på utsidan ringen av varje rätt. Byt pipett tips ofta. Täck över och återgå till inkubatorn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De metoder som beskrivs här tillåter fina upplösning på morfologiska och neurokemiska funktioner i centrala dopaminneuron som annars inte finns tillgängliga i en systemisk eller in vivo-metod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Arbetet stöddes av DK065872 (ENP), en Smith Family Foundation Award of Excellence inom biomedicinsk forskning (ENP), F31 DA023760 (BMG, ENP) och P30 NS047243 (Tufts Center for Neuroscience Research).

Materials

Materials are included in the protocol text.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
  2. Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
  3. Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
  4. Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
  5. Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).

Comments

29 Comments

  1. Excellent!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2008 - 11:03 AM
  2. I would like to thank Lauren and Emmanuel for such an excellent piece of science. I was thinking of setting up the method in my lab and the video encouraged me to do so. Sure it helps a lot!!! Hope to see more like this video in the future.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 13, 2009 - 11:59 AM
  3. Thank you very much for this wonderful protocol. I am very excited to try this out. Could you please let me know what kind of plates you used for plating the glia and where did you buy the slide rings from (catalog number perhaps). Thanks a bunch!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2009 - 4:38 PM
  4. Thank you for the comment and we are happy to help. The dishes were ordered from World Precision Instruments: FlouroDish FD35PDL-100, tissue culture dish with cover glass bottom, dish:35mm glass:²3mm. Thanks, Lauren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 11:20 AM
  5. And slide rings: Thomas 6705-R1² Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 1:57 PM
  6. can you please tell me how to separate astrocyte from neurons using serum coating. please send a protocol if possible. thanks Gaurav jain gauravjain_niper@yahoo.co.in

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:27 PM
  7. We do not have a protocol to separate astrocytes from neurons, all our cell sorting is done through immunocytochemistry on fixed tissue. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 24, 2009 - 3:21 PM
  8. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:18 AM
  9. Cortical astrocytes are the best option as the midbrain dŒs not provide as high a yield. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2009 - 7:44 AM
  10. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:28 AM
  11. Hi, the astrocytes we derive from cortical tissue (higher yield than in the midbrain).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:14 PM
  12. Hi there,

    It's great to find this info online, many thanks for submitting it. Can I ask what kind of % DA neuron yields you're getting this way?

    Cheers,

    Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 9:39 AM
  13. The yield is in the range of 40-60% if cells are plated in the presence of GDNF. Otherwise, the yield is in the range of 10-²0%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:17 PM
  14. Hi again,

    Sorry, i had one other thing to ask if I may. We have a lot of experience with hippocampal dissociated cultures and would be interested in seeing whether the midbrain cultures can work with the media we use for these (Neurobasal and variants); in trying this, is there any specific nutritional or medium requirement of DA neurons you've identified that we should be aware of, which isn't likely to be something we are already giving the hippocampal neurons? I see you include things like catalase and kynurenic acid that aren't in our medium......I presume these are to minimise oxidative and excitotoxic stress? Can i ask, do you have an idea of how much these improve the yield by? Many thanks again, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 10:36 AM
  15. As mentioned above, the single most critical factor in improving dopamine neuron yield is GDNF.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:19 PM
  16. Many thanks indeed for this information, that's really helpful. cheers,
    Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 4:46 PM
  17. Sorry, one final one from me - have you ever tried the Banker method with these? I have heard this dŒsn't work as well as having the cell layers in full contact, is this your experience? Is it very much worse? I am very interested in trying Banker because a neuronal monolayer would work much better with the microscopy set up I want to use! Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 19, 2010 - 4:59 AM
  18. No, we have not tried the Banker protocol on this.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2010 - 12:25 PM
  19. Hello, I wonder if I can ask what you coat your culture dishes with before plating astrocytes? I am finding that mouse glia may be quite sensitive to the usual things like poly-D-lysine etc. Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2010 - 9:01 AM
  20. Poly-D-lysine is fine for rat astrocytes, laminin is better for mouse astrocytes (although poly-D-lysine has also worked for us in mouse cultures).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 28, 2010 - 2:56 PM
  21. Hi, thanks for the protocol. Can you explain why you use P0-P² mice? I am looking to study early DA neurons from what would become the VTA and was planning on using embryonic brains, so wondered what the reason was for using neonatal brains here.

    Many thanks,
    Naomi

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 4, 2012 - 10:29 AM
  22. Using embryonic instead of neonatal brains with this procedure would be fine provided that you account for adequate brain development in utero. To be safe and ensure health of the dopamine cell bodies in culture, I would avoid using embryos prior to the third trimester of gestation. We have not used dissociated cultures for precursors to dopamine neurons so I am not really qualified to vouch for the viability of such preparations. Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 18, 2012 - 6:55 PM
  23. Ok, thank you!

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 19, 2012 - 4:20 AM
  24. Hi Naomi, the protocol should work with embryonic brains as well (provided you allow for development of DA neurons) but the dissection is going to be much more challenging. I would suggest you culture neurons from the midbrain (both VTA and nigra) in that case to allow for the difference in size of the brain sites you are targeting. MIcrodissection techniques may also help, but you have to find the way to get your tissue in carbogenated media ASAP.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:44 PM
  25. Thank you for posting such a great informational video. I have a follow-up question to the previous question on this page: would it also be appropriate to use postnatal day 2-5 mice instead of PN 0-2? I ask because I have seen other protocols to culture primary dopamine neurons that use older mice (for example, Smeyne and Smeyne, 2002).

    Thanks,
    Brittany W.

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    July 5, 2013 - 2:18 PM
  26. Hi Brittany, you can try with P2-P5 but it is not optimal. P0-P2 would typically give you the highest yield in live DA cells in culture, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:47 PM
  27. Thanks!

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    November 21, 2013 - 2:39 PM
  28. Hi, The protocol is explained and shown very nicely. I want to do only dopaminergic neuron culture. Is it possible to do the culture without glia or seeding it directly on poly d lysine coated plates. In your protocol you have added FDU to kill dividing cells (glia), does it kill all within and outside the ring in the plate, and you get only dopminergic cells at the end. Would you please help and suggest a bit. Thanks. Farah

    Reply
    Posted by: Farah S.
    November 20, 2013 - 10:27 AM
  29. Hi Farah, we have not been able to produce DA cell cultures without plating glia, the latter are needed to condition the media and help sustain the culture for several weeks. If you only think of acute experiments, it might be possible to isolate DA cells for a few hours, but they would have no neurites, they would be difficult to identify as DA neurons and they would die very fast. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:51 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics