Principal Dissociated Midbrain dopamina culturas de células de recém-nascidos de roedores

Biology

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Summary

Principal dissociada mesencéfalo culturas de células de dopamina permitir o estudo das características pré-sináptica dos neurônios dopaminérgicos. Eles podem ser usados ​​para monitorar em tempo real a cinética de liberação de dopamina e proteína / mRNA níveis de reguladores de exocitose dopamina. Aqui, nós mostrar-lhe como gerar essas culturas de recém-nascidos de roedores.

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Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates. J. Vis. Exp. (21), e820, doi:10.3791/820 (2008).

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Abstract

A capacidade de criar culturas de células primárias de neurônios de dopamina permite o estudo das características pré-sináptica dos neurônios de dopamina no isolamento da entrada sistêmica de outras partes do cérebro. Em nosso laboratório, usamos esses neurônios para avaliar a cinética de liberação de dopamina usando amperometria de fibra de carbono, bem como níveis de expressão de genes relacionados a dopamina e proteínas usando PCR quantitativo e imunocitoquímica. Neste vídeo, vamos mostrar como podemos gerar essas culturas de recém-nascidos de roedores.

O processo envolve várias etapas, incluindo o revestimento de astrócitos corticais glial, o condicionamento de meios de cultura de células neuronais pelo substrato glial, a dissecção do mesencéfalo em recém-nascidos, a digestão, extração e cultivo de neurônios de dopamina e da adição de fatores neurotróficos para garantir a sobrevivência da célula.

As aplicações adequadas para tal preparação incluem eletrofisiologia, imunocitoquímica, PCR quantitativo, a microscopia de vídeo (ou seja, em tempo real de fusão vesicular com a membrana plasmática), ensaios de viabilidade celular e outras telas toxicológicos.

Protocol

Precedendo a preparação Cultura

Nota: ** As células gliais deve ser banhado com bastante antecedência para que eles tenham tempo para proliferar e cobrir o fundo dos pratos. Para camundongos com atípica ou experimental fundo genético, certifique-se para combinar as culturas gliais e neuronais, em termos de genótipo.

Nota: ** 1-7 dias antes da dissecação, prepare neuronal médio fresco e substituir o médio glial nos pratos com 2 ml.

Nota: ** No dia antes da dissecação, os seguintes itens devem ser deixados sob luz UV durante a noite:

  • 4 placas de dissecção
  • 2 frascos de dissociação com uma barra de agitação magnética micro-
  • 2 tampas dos frascos (com dois pequenos furos poked no topo)
  • Espalhar-se anéis de slides (e revestimento em EtOH 70%) - deixe a caixa aberta também
  • PELO MENOS duas caixas cheias de amarelos (10-200μl) ponteiras
  • 1 caixa de azul (100-1000μl) ponteiras

Dia da Cultura

Nota: * Certifique-se não tocar em nada que ficou de fora para UV durante a noite!

Manter um ambiente estéril sob a capa é muito importante.

1) Defina Up:

Nota: ** Retiradas todos os ingredientes congelados para fazer a solução de papaína.

  1. Pinça limpa com EtOH 70%. Cobrir cada ponta com uma ponta de pipeta estéril amarelo. Usar para colocar anéis de deslize estéril em sua caixa.
  2. Chapa quente:
    1. Colocar uma placa mini-magnetic/hot sob o capô com um copo cheio até 1000ml 500-600ml dH 2 O e uma barra de agitação magnética grande.
    2. Coloque um disco de isopor no copo um pouco acima do nível da água.
    3. Deslize o termômetro em um pequeno buraco no disco de isopor. Discagem de calor precisa ser ligeiramente superior a 2 (para uma temperatura de 34 ° C) e agitar o disco deve ser ~ 5-6.
  3. PBS:
    1. Prepare PBS estéril e estéril preencher 15 tubos 15ml com 4-6 ml (não se esqueça de manter estéreis
      técnica).
    2. Coloque os tubos ea garrafa de ações no gelo ao lado do capô.
  4. Carbogênio:
    1. Quebrar um stripette 5ml pela metade e empurrá-lo através de uma rolha de borracha, de forma a ponta do stripette está saindo da extremidade larga da rolha.
    2. Coloque a tampa em um frasco de 500ml com 400-500ml dH 2 O (fim quebrada de stripette deveria estar no 2 dH O).
    3. Ligar um tubo na abertura lateral do balão.
    4. Corte a ponta fora uma ponteira amarela e ligar isto à extremidade do tubo (com o lado cortado virado para fora).

      Conecte o tanque carbogênio para a ponta do stripette 5ml.

  5. Prepare papaína sol'n:
    1. * Use técnica estéril cuidado.
    2. Misture em um tubo de 50ml estéril.
  6. Filtro de papaína sol'n dentro do frasco de dissociação:
    1. Use uma unidade de filtragem Steriflip e transferir para frasco 25ml dissociação via stripette (OR colocar um filtro nova seringa 0,2 Hm na ponta do êmbolo de uma seringa de 20 ml,
      remover o êmbolo e usar um stripette (25 ml) para transferir todos os sol'n papaína para a seringa.
    2. Filtro no frasco dissociação).
    3. Cap do frasco, inserir uma seringa estéril através do orifício na tampa e coloque um filtro de seringa estéril 0,2 Hm à base da seringa.
    4. Conecte o carbogênio para o filtro e este lugar em parafilme. Coloque o frasco na isopor disco / suporte.

      * O bar agitar micro-magnético deve estar se movendo.
      * O gás deve ser tornando-o dentro do frasco.
      * A temperatura deve se estabilizar em 34 ° C.

  7. Prep dissecção:
    1. Traga o microscópio de dissecção sob o capô.
    2. Lay out de todos os instrumentos de dissecação em folha de alumínio, spray com EtOH 70%, despeje o excesso e deixe sob o capô para secar.
  8. Prepare médio neuronal:
    1. Deixe 30ml de meio de neuronal fresco na incubadora.
  9. Lay out uma grande praça de folha de alumínio e 12 quadrados menores. Deixe a tesoura decapitação com a folha de alumínio. Encher uma caixa de isopor pequeno com água gelada e deixar todos fora do capô.
  10. Prep a anestesia (ketamina 0.075ml e 0.075ml xzylazine).
  11. Obter pelo menos 12 filhotes (P0-P2) para 100 placas. Para camundongos, certifique-se que há um jogo de genótipo para o lixo todo. Se o genótipo é desconhecido, as células da placa de cada filhote de cachorro em um prato separado, manter registros precisos de números de mouse e combiná-los com pratos de cultura de células e certifique-se a base genética do substrato gliais é uniforme em culturas de células.

2 Dissection)

  1. Anestesiar o animal pela primeira vez com uma injeção intraperitoneal. Quando animais mostra sedação e não responde à cauda filme-ensaio, colocá-lo em gelo por 30 segundos (até hipotermia). Lave uma pequena folha de alumínio quadrada, Decaptesoura de citações, e cabeça com EtOH 70%.
  2. Decapitar, permitir que a cabeça a cair para o quadrado de papel alumínio e mover-se sob o capô. Remova cuidadosamente cérebro em um tubo de 15ml de PBS gelado. Colocar o tubo de volta no gelo durante a remoção do cérebro que vem.
  3. Repita estes primeiros passos, até há 3 cérebros no gelo. Despeje todos os três cérebros e PBS para o prato dissecção primeira sob o microscópio. Remover seção apropriada do cérebro (VTA) e usar uma pipeta de transferência para colocar os segmentos em papaína sol'n. Iniciar um temporizador quando os segmentos primeiro ir dentro
  4. Repita últimos 3 etapas até que todos os cérebros estão sendo digeridos no papaína. O tempo médio para a digestão deve ser de 2 horas. Os segmentos de primeira terá sido em cerca de uma hora pelo tempo que os últimos ir dentro

    Tente dividir a diferença.

  5. * Durante a digestão:
    1. Certifique-se que a temperatura no banho é de 34 ° C.
    2. Segmentos podem aderir à barra de agitação no início, mas deve espalhar-se como o tempo passa. Se não o fizerem, toque no fundo do frasco.

3) Trituração:

  1. Usando uma pipeta, transferir os segmentos do cérebro para um tubo estéril 15ml (tentar evitar excesso de papaína sol'n) e lave-os 3 vezes com 2 ml de meio de glial aquecido da incubadora. Depois de colocar a mídia glial no tubo, permitem segmentos para resolver e, em seguida, remova cuidadosamente como sol'n tanto quanto possível, sem perturbar os segmentos. Alterar pipetas para evitar a contaminação!

    ** Não manter o sol'n que é removido.

  2. Usando uma pipeta frescas começam triturações em 2ml de mídia glial. Triturar 25 vezes (em evitar que bolhas de ar) e deixar o tubo de sentar-se por 3 minutos até que os segmentos não dissociado resolver. Use uma pipeta para remover e MANTER sol'n, tanto quanto possível, sem perturbar os segmentos na parte inferior. Manter o sobrenadante em um tubo (estéril) novos 15m.
  3. Repita o passo anterior, utilizando uma pipeta 1000μl e pipetar 200μl até que esteja completamente dissociado.
  4. Triturar 10 vezes com uma pipeta, transferir ou até que as células estão completamente suspensas em sol'n.

4) Células Plating

  1. Usando uma pipeta estéril amarela cobrindo cada ponta da pinça, cuidadosamente uma gota anel slide como centrado no vidro tão bem quanto possível dentro de cada prato.
  2. Colocar 10μl da solução de célula na hemocitômetro e contar. (Excluir massas junk).
  3. Multiplicar o número de células por 10. Este é o número de células / ml. Divide 1,000,000-1,500,000 (ou densidade desejada) por este número. Este é o número de mL para adicionar por prato.
  4. Use a ponta da pipeta para deslizar anéis sobre o centro-bem de cada prato que você adicionar mL apropriado / prato. Placa-los suavemente e passar dicas para cada prato.
  5. Adicionar 100μl (de diluído) GDNF sol'n dentro do anel de slides de cada prato.
  6. Neste momento, coloque as bandejas na incubadora e trazer o meio neuronal na sala fria.
  7. Permitem que as células para resolver durante a noite.
  8. Dia seguinte: retire anéis (usando novas pontas de pipeta estéril cobrindo as pontas pinças para cada prato)

5) A inibição mitótica: no dia seguinte

  1. Diluir alíquotas FDU de 1:10 estoque 1000X adicionando estoque FDU 200μl para 1,8 ml MEM estéril.
  2. Adicionar 20μl diluída FDU sol'n ao anel exterior de cada prato. Trocar a ponteira com freqüência. Cubra e retornar à incubadora.

    * Perturbe os pratos tão pouco quanto possível para os próximos dias 7-10. Verifique se há pratos infectados e remover todos os pratos infectadas nos primeiros sinais de infecção. Culturas estão prontos para testes dentro de 3 semanas.

MEDIA / SOLUTIONS

Médio neuronal

(Para 200 ml)

** Melhor se condicionando a glia de frascos durante a noite antes de usar para lavagens / trituração

Ingrediente Quantidade Notas
BSA 5% 0,5 g V fração
Líquido MEM 94,0 ml Sigma
Líquido DMEM 80,0 ml Sigma
F-12 líquidos 20,0 ml Sigma
Líquido de glicose 45% 1,50 ml Sigma solução
Glutamina 200mM 0,5 ml Solução Sigma aliquotado
Diporzio Conc. 2,0 ml Sigma solução
Líquido Catalase 0,1 ml
Ácido cinurênico 0.5M 200μl Em NaOH 1N
HCL 5N 50 ul

  1. Misture os ingredientes (BSA vai durar) em 250ml garrafa de plástico.
  2. Label, filtrar e refrigerar.

Ácido cinurênico
(FW = 189,2)
0,5 M = 94.6mg/ml
Fazer estoque 8ml: 756.8mgKA/8ml NaOH 1N e pipetar em alíquotas de 200μl ESTÉRIL



DiPorzio Mídia

A) DiPorzio Conc. Ações:

NECESSIDADE Combinar Alliquot
Aditivo Solvente Tubo Quantidade ml ml / tubo Conc. Quantidade # Aliq.
Insulina HCL 20mM (1) plástico Garrafa de 250mg 10 1 25mg/ml 25mg 10
Transferrina Hank Frasco de 500mg 5 1 100mg/ml 100mg 5
SOD Hank Frasco 70mg 14 1 5mg/ml 5mg 14
Putrescina Hank 50mg 3 0,12 20mg/ml 2.4mg 21
Na 2 SeO 3 Hank 0.104mg 10 0,5 10μg/ml 5.2μg 20
T3 10mM NaOH 2mg 10 0,1 0.20mg/ml 0mg 100
Progesterona 100% EtOH Vidro 12.5mg 10 0,05 1.25mg/ml Use pipeta
Cortisol 100% EtOH Vidro 20mg 10 0,02 2.00MG / ml Use pipeta

  1. 20mM HCl = 41.5μl conc. HCl/25ml.
  2. Fazer estoque 1mg/ml e adicionar 104μl de 10ml.



B) DiPorzio stock Media:

Aditivo Quantidade (ml) Quantidade (ml) X2 Conc final. mcg / ml Conc final. Molaridade
Progesterona 0,05 0,1 0,06 200nM
Cortisol 0,02 0,04 0,04 125nM
BSS Hank 6,21 12,42
Insulina 1 2 25
Na 2 SeO 3 0,5 1 0,01 30nM
T3 0,1 0,2 0,02 30nM
SOD 1 2 5
Putrescina 0,12 0,24 2,4 15nm
Transferrina 1 2 100

  1. Use um tubo de 15ml polyproylene estéril para adicionar a progesterona e cortisol. Use uma pipeta de aspiração e vácuo para acelerar a evaporação do etanol: (use um stripette 5ml quebrado ao meio e coloque metade do caminho para baixo dentro do tubo sendo muito cuidadoso para não aspirar líquido EtOH pipeta Segure firmemente no lugar com Kimwipes e depois trazer a ponta. até a marca de 500μl localizado no lado do tubo.
  2. Adicione o alíquotas subseqüentes na ordem em que aparecem no gráfico acima.
  3. Após a adição de insulina, o que torna a nublado sol'n, adicionar 20μl de NaOH 1N para neutralizar o pH. Sol'n deve ir do amarelo ao rosa e imediatamente claro. Além disso, após a adição de transferrina, imediatamente adicionar 20μl de NaOH 1N, para neutralizar o pH e prevenir a formação de precipitados.
  4. Elaborar 10ml em uma pipeta sorológica e se dividem em cinco alíquotas (um lote).
  5. Loja @ -20 ° C.
  6. Pode fazer 2 lotes de uma só vez.

Dissociação Mídia

A. papaína (para 1 frasco):

** Prepare dia de chapeamento de direito antes da dissecção.

Ingrediente Quantidade </ Strong> (Notas) Conc Final.
Água Cisteína 7.8mL Cisteína 1mM
Papaína Varia (* 190μl para a garrafa de
44.0mg/ml)
20 unidades / ml (400 unidades totais
para o valor de 20ml de sol'n)
H & B conc. 2mL
Carbogênio 95% O2 + 5% de CO2
HCl 5N 10μl
0,5% de vermelho de fenol 20μl 0,001%
Kynurenate 0.5M 10μl (Em 1N NaOH) 0,5 mM

  1. Adicionar papaína para a água cisteína FIRST.
  2. Adicione o conc H & B., Kynurenate, HCl, e vermelho de fenol.
  3. Filtro no frasco de dissociação (conforme descrito nas direções set-up) e se conectar à carbogênio.


B. H & B Concentrado (100ml de 5X):

Ingredientes MW Powder/50ml H 2 O Conc. (M) Combine (ml) Conc final. (MM)
NaCl 58,44 11,699 g 4 14,5 116
KCl 74,56 3,728 g 1 2,7 5,4
NaHCO 3 84,01 4,2 g 1 13 26
NaH 2 PO 4 * H 2 O 137,99 6,90 g 1 1 2
MgSO 4 120,38 6,019 g 1 0,5 1
EDTA (ED2-SS)
292 Sigma 5% (make
5g/100ml estoque)
0,134 0,3722 0,5
Glicose 180 Sigma 45% 2,5 5 25
TC H 2 O 62,93

  1. Combine as quantidades a partir de soluções estoque.
  2. Dividir em alíquotas 4ml.
  3. Adicionar alíquota à água após a adição de cisteína papaína.

C. Água Cisteína (157.5ml de 1X):

Ingredientes MW Componentes
Em pó (mg)
H 2 O (ml) Ações Conc. (MM) Combine (ml) Conc final. (MM)
CaCl 2 147,2 736 10 500 0,6 1,9 mm
Cisteína 121,7 (1.5) 24 20mm (0,02 m) 10 1,27
(0.88)
Água TC 146,9

  1. Fazer e manter um estoque de sol'n CaCl2 0,5 M a 4 ° C
  2. Faça uma sol'n usar um dos cisteína e combinar com outros ingredientes
  3. Divida em 10 alíquotas de 15,75 ml e armazenar a 4 ° C


GDNF Preparação

  1. Prep alíquota:
    1. Dissolver estéril, pellet liofilizado de 5μg GDNF com 2,4 ml de água deionizada estéril. A concentração desta sol'n GDNF = 2.08μg/mL.
    2. Distribuir o 2.08μg/mL GDNF sol'n em 76.9μl alíquotas em criotubos estéril. Este 160ng = por frasco.
    3. Armazenar a -20 ° C.
  2. Além de culturas:
    1. Descongelar uma alíquota para cada 8 pratos.
    2. Diluir alíquota, adicionando 723.1μl media neuronal / alíquota. Isto fará uma sol'n 160ng/800μl de GDNF.
    3. Adicionar 100μl deste sol'n para a 2 ml de meio em cada prato para uma concentração final de 10ng GDNF por mL.


FDU Preparação

FDU-sol'n stock 1000X:

Ingrediente Quantidade (Notas) Conc Final.
Uridina 247 mg 16,5 mg / ml
5 FDU (5-fluorodeoxyuridine) 100 mg (frasco) 6,7 mg / ml
Água TC 15 ml

  1. Fazer um pouco mais de 15 ml de 16,5 uridina mg / ml.
  2. Adicionar 15 ml uridina sol'n a 100 mg de garrafa FDU para fazer 6,7 mg / ml sol'n FDU.
  3. Dividir em alíquotas 200μl e congelar em -20 ° C.

Diluir para Uso:

  1. Inibir o crescimento de células não-neuronais. Diluir 1:10 estoque 1000X adicionando estoque 200μl para 1,8 ml de MEM.
  2. Adicionar 20μl FDU diluído ao anel exterior de cada prato. Alterar pontas de pipeta com freqüência. Cubra e retornar à incubadora.

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Discussion

Os métodos descritos aqui permitem resolução fina de características morfológicas e neuroquímicas dos neurônios dopaminérgicos centrais que não estão disponíveis de outra forma em uma abordagem sistêmica ou em vivo.

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Acknowledgements

O trabalho foi suportado por DK065872 (PEV), uma Smith Award Foundation Família de Excelência em Pesquisa Biomédica (PEV), F31 DA023760 (BMG, PEV) e P30 NS047243 (Tufts Center for Neuroscience Research).

Materials

Materials are included in the protocol text.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
  2. Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
  3. Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
  4. Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
  5. Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).

Comments

29 Comments

  1. Excellent!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2008 - 11:03 AM
  2. I would like to thank Lauren and Emmanuel for such an excellent piece of science. I was thinking of setting up the method in my lab and the video encouraged me to do so. Sure it helps a lot!!! Hope to see more like this video in the future.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 13, 2009 - 11:59 AM
  3. Thank you very much for this wonderful protocol. I am very excited to try this out. Could you please let me know what kind of plates you used for plating the glia and where did you buy the slide rings from (catalog number perhaps). Thanks a bunch!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2009 - 4:38 PM
  4. Thank you for the comment and we are happy to help. The dishes were ordered from World Precision Instruments: FlouroDish FD35PDL-100, tissue culture dish with cover glass bottom, dish:35mm glass:²3mm. Thanks, Lauren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 11:20 AM
  5. And slide rings: Thomas 6705-R1² Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 1:57 PM
  6. can you please tell me how to separate astrocyte from neurons using serum coating. please send a protocol if possible. thanks Gaurav jain gauravjain_niper@yahoo.co.in

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:27 PM
  7. We do not have a protocol to separate astrocytes from neurons, all our cell sorting is done through immunocytochemistry on fixed tissue. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 24, 2009 - 3:21 PM
  8. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:18 AM
  9. Cortical astrocytes are the best option as the midbrain dŒs not provide as high a yield. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2009 - 7:44 AM
  10. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:28 AM
  11. Hi, the astrocytes we derive from cortical tissue (higher yield than in the midbrain).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:14 PM
  12. Hi there,

    It's great to find this info online, many thanks for submitting it. Can I ask what kind of % DA neuron yields you're getting this way?

    Cheers,

    Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 9:39 AM
  13. The yield is in the range of 40-60% if cells are plated in the presence of GDNF. Otherwise, the yield is in the range of 10-²0%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:17 PM
  14. Hi again,

    Sorry, i had one other thing to ask if I may. We have a lot of experience with hippocampal dissociated cultures and would be interested in seeing whether the midbrain cultures can work with the media we use for these (Neurobasal and variants); in trying this, is there any specific nutritional or medium requirement of DA neurons you've identified that we should be aware of, which isn't likely to be something we are already giving the hippocampal neurons? I see you include things like catalase and kynurenic acid that aren't in our medium......I presume these are to minimise oxidative and excitotoxic stress? Can i ask, do you have an idea of how much these improve the yield by? Many thanks again, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 10:36 AM
  15. As mentioned above, the single most critical factor in improving dopamine neuron yield is GDNF.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:19 PM
  16. Many thanks indeed for this information, that's really helpful. cheers,
    Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 4:46 PM
  17. Sorry, one final one from me - have you ever tried the Banker method with these? I have heard this dŒsn't work as well as having the cell layers in full contact, is this your experience? Is it very much worse? I am very interested in trying Banker because a neuronal monolayer would work much better with the microscopy set up I want to use! Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 19, 2010 - 4:59 AM
  18. No, we have not tried the Banker protocol on this.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2010 - 12:25 PM
  19. Hello, I wonder if I can ask what you coat your culture dishes with before plating astrocytes? I am finding that mouse glia may be quite sensitive to the usual things like poly-D-lysine etc. Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2010 - 9:01 AM
  20. Poly-D-lysine is fine for rat astrocytes, laminin is better for mouse astrocytes (although poly-D-lysine has also worked for us in mouse cultures).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 28, 2010 - 2:56 PM
  21. Hi, thanks for the protocol. Can you explain why you use P0-P² mice? I am looking to study early DA neurons from what would become the VTA and was planning on using embryonic brains, so wondered what the reason was for using neonatal brains here.

    Many thanks,
    Naomi

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 4, 2012 - 10:29 AM
  22. Using embryonic instead of neonatal brains with this procedure would be fine provided that you account for adequate brain development in utero. To be safe and ensure health of the dopamine cell bodies in culture, I would avoid using embryos prior to the third trimester of gestation. We have not used dissociated cultures for precursors to dopamine neurons so I am not really qualified to vouch for the viability of such preparations. Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 18, 2012 - 6:55 PM
  23. Ok, thank you!

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 19, 2012 - 4:20 AM
  24. Hi Naomi, the protocol should work with embryonic brains as well (provided you allow for development of DA neurons) but the dissection is going to be much more challenging. I would suggest you culture neurons from the midbrain (both VTA and nigra) in that case to allow for the difference in size of the brain sites you are targeting. MIcrodissection techniques may also help, but you have to find the way to get your tissue in carbogenated media ASAP.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:44 PM
  25. Thank you for posting such a great informational video. I have a follow-up question to the previous question on this page: would it also be appropriate to use postnatal day 2-5 mice instead of PN 0-2? I ask because I have seen other protocols to culture primary dopamine neurons that use older mice (for example, Smeyne and Smeyne, 2002).

    Thanks,
    Brittany W.

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    July 5, 2013 - 2:18 PM
  26. Hi Brittany, you can try with P2-P5 but it is not optimal. P0-P2 would typically give you the highest yield in live DA cells in culture, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:47 PM
  27. Thanks!

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    November 21, 2013 - 2:39 PM
  28. Hi, The protocol is explained and shown very nicely. I want to do only dopaminergic neuron culture. Is it possible to do the culture without glia or seeding it directly on poly d lysine coated plates. In your protocol you have added FDU to kill dividing cells (glia), does it kill all within and outside the ring in the plate, and you get only dopminergic cells at the end. Would you please help and suggest a bit. Thanks. Farah

    Reply
    Posted by: Farah S.
    November 20, 2013 - 10:27 AM
  29. Hi Farah, we have not been able to produce DA cell cultures without plating glia, the latter are needed to condition the media and help sustain the culture for several weeks. If you only think of acute experiments, it might be possible to isolate DA cells for a few hours, but they would have no neurites, they would be difficult to identify as DA neurons and they would die very fast. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:51 PM

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