माउस भ्रूणीय स्टेम (एमईएस) हैंगिंग ड्रॉप विधि का उपयोग कोशिकाओं की इन विट्रो भेदभाव में

Biology

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Summary

इस वीडियो को दर्शाता है कैसे माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं की इन विट्रो भेदभाव में embryoid निकायों को फांसी ड्रॉप विधि का उपयोग आचरण.

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Wang, X., Yang, P. In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method. J. Vis. Exp. (17), e825, doi:10.3791/825 (2008).

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Abstract

स्टेम सेल उल्लेखनीय कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं में विकसित करने की क्षमता है. जब एक स्टेम सेल बिताते हैं, प्रत्येक नया सेल करने के लिए या तो एक स्टेम सेल रह सकता है या एक अधिक विशिष्ट समारोह के साथ सेल का एक प्रकार बन क्षमता है, विज्ञान के इस होनहार वैज्ञानिकों सेल आधारित चिकित्सा की संभावना की जांच करने के लिए बीमारी का इलाज अग्रणी है. जब antidifferentiation कारकों के बिना निलंबन संस्कृति में, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं अनायास अंतर और तीन आयामी multicellular समुच्चय के रूप में. ये सेल समुच्चय embryoid निकायों (EB) कहा जाता है. हैंगिंग ड्रॉप संस्कृति एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया EB गठन प्रेरण विधि है. फांसी बूंद के गोल नीचे ES कोशिकाओं का एकत्रीकरण जो एमईएस कोशिकाओं बनाने ईबीएस के लिए एक अच्छा माहौल प्रदान कर सकते हैं अनुमति देता है. एक फांसी ड्रॉप में aggregatied ES कोशिकाओं की संख्या प्रारंभिक सेल पेट्री डिश के ढक्कन से एक बूंद के रूप में लटका दिया जा निलंबन में कोशिकाओं की संख्या अलग से नियंत्रित किया जा सकता है. इस पद्धति का उपयोग करके हम reproducibly ES कोशिकाओं के एक पूर्व निर्धारित संख्या से सजातीय ईबीएस फार्म कर सकते हैं.

Protocol

  1. T75 एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 टिशू कल्चर इनक्यूबेटर रातोंरात एक दिन पहले में 0.1% जिलेटिन समाधान और सेते प्लेट का उपयोग कर फ्लास्क सरेस लगाना.
  2. एमईएस कोशिकाओं से सेते ले लो, मध्यम aspirate, पीबीएस के साथ ES सेल संस्कृति कुल्ला करने के लिए, 0.05% trypsin समाधान जोड़ने के पकवान के नीचे कोट (2 ml/100mm थाली) के लिए.
  3. 37 डिग्री लगभग 1 मिनट के लिए सी सेते हैं, जब तक कोशिकाओं से थाली sloughing हैं.
  4. धीरे triturate (pipet और नीचे) trypsinized कोशिकाओं चार से छह बार एक खामियों को दूर पाश्चर विंदुक के साथ ES कोशिकाओं को फैलाने के लिए. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) एमईएस मध्यम युक्त ट्यूब में बिखरे ES कोशिकाओं स्थानांतरण.
  5. Centrifugation द्वारा कोशिकाओं लीजिए. सतह पर तैरनेवाला Aspirate, एमईएस माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें और ऊपर और नीचे एक एकल कक्ष निलंबन के रूप में विंदुक.
  6. एक T75 के साथ 0.1% जिलेटिन और सेते पूर्व लेपित फ्लास्क में 37 में सेल निलंबन ° स्थानांतरण सी एक घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ

    * एक घंटे के बाद, fibroblasts थाली करने के लिए संलग्न है, लेकिन स्टेम कोशिकाओं मध्यम में रहते हैं. स्टेम कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए मध्यम पिपेट.

  7. 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर कोशिकाओं को घुमाओ और बंद एमईएस मध्यम aspirate. फिर एमईएस भेदभाव माध्यम के एक 10 मिलीलीटर जोड़ने और दोहराव pipetting द्वारा कोशिकाओं resuspend जब तक वहाँ के लिए कक्षों की एक ठीक निलंबन प्रतीत होता है.
  8. एक hemocytometer उपयोग भेदभाव माध्यम से कोशिकाओं की गणना के लिए एक बाँझ बेसिन में 400 से 500 प्रति 20ul (20ul/drop) कोशिकाओं के एक एकाग्रता के लिए स्टेम सेल निलंबन पतला.
  9. ढक्कन लिफ्ट, ध्यान से यह पलटना और पीबीएस के 10 मिलीलीटर युक्त डिश के शीर्ष पर यह जगह. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, टिशू कल्चर पकवान के ढक्कन के ऊपर बने भीतरी सतह पर 20ul बूंदों की पंक्तियाँ बनाते हैं.
  10. ध्यान इनक्यूबेटर में 2 दिनों के लिए पकवान जगह है. दो दिनों के बाद, ध्यान से प्लेट कवर पर बारी, 180 उल ताजा भेदभाव मध्यम aspirate और ultralow 96 अच्छी तरह से लगाव थाली का अच्छी तरह से में कई बूँदें डाल. विंदुक और हस्तांतरण बूँदें, एक एक करके, 96 अच्छी तरह से थाली के साथ ड्रॉप पिक तो. 3 दिनों के लिए undisturbed इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस.
  11. प्रत्येक की अच्छी तरह से 300ul 0.1 जिलेटिन% के साथ 48-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली कोट. जेलाटीन जोड़ने के बाद, 37 पर थाली रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस एक दिन आगे से पहले ईबीएस हस्तांतरण.
  12. अगले दिन, 48-अच्छी तरह से थाली से जिलेटिन aspirate. फिर प्रत्येक अच्छी तरह से भेदभाव के माध्यम से 300 उल जोड़ें. ईबीएस 96 अच्छी तरह प्लेटें से 48 अच्छी तरह से जिलेटिन लेपित एक से एक प्लेटों पर स्थानांतरण. मध्यम अगले दिन बदलें और फिर हर दूसरे दिन मध्यम बदलने के लिए कोशिकाओं को बनाए रखने.
  13. स्वतःस्फूर्त cardiaomyocyte संकुचन 7 दिनों के भीतर स्पष्ट किया जाना चाहिए.

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Discussion

फांसी ड्रॉप विधि के नुकसान के रूप में निम्नानुसार हैं: एक बूंद के तरल मात्रा 50ul कम से कम करने के लिए सीमित की वजह से सतह तनाव द्वारा ढक्कन पर फांसी बूँदें बनाए रखने के लिए, और यह असंभव है बूँदें फांसी के लिए मध्यम को बदलने. माइक्रोस्कोपी के साथ सीधे बूंदों में ईबीएस बनाने के अवलोकन से भी खेती के दौरान बहुत मुश्किल है. और इसके अलावा, फांसी ड्रॉप विधि दो चरणों के होते हैं, इसलिए फांसी ड्रॉप विधि के कदम की एक श्रृंखला परेशानी हो सकता है.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
DMEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum(FBS) Reagent Hyclone SH30070.03
L-Glutamine Reagent GIBCO, by Life Technologies 25030
Non-Essential Amino Acids Reagent GIBCO, by Life Technologies 11140-050
Penicllin / Streptomycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
Sodium Pyruvate Reagent GIBCO, by Life Technologies 11360-70
β-mercapt–thanol Reagent Chemicon International ES-007-E
leukemia inhibitory factor(LIF) Reagent Chemicon International LIF2005
96-well ultralow attachment plate Tool Corning 3474

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References

  1. Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
  2. Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).

Comments

7 Comments

  1. Dear Doctor Xiang Wang,  your technique appear useful and very interesting. I' m studying mES and I want to differentiate them into simple embryoid bodies, but not into predefinite cells. So I have a question for you. The differentiation medium could be a stem cell medium just without LIF? Or do I need to add some elements to my medium to produce embryoid bodies? Thank you very much and best regards,  Barbara Tondelli.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 7:13 AM
  2. hi, i work together w/ xiang. he returned to china so i asked him to respond to you but in case he dŒsn't, let me answer: 1. yes. embryoid bodies can be made w/ the stem cell medium w/o lif. you need to create a voumetric clusters. this could be done using the hanging drop method or plate in cluster of cells. we have had best exerience making hanging drop. hope this helps.   phil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 12:09 PM
  3. Hello I want to know the function and concentration here of sodium pyvurate. Can the heartbeat appear in a differentiation medium without sodium pyvurate? And if the plates are taken out sometimes during the suspension culture period, dŒs it matter so much? I've been trying but no cardiocytes seemed to appear, and I cannot find the key to this. Thank you a lot!  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2008 - 3:02 AM
  4. Dear Huijun Zhu,   I use 1mM Sodium pyvurate for mESC culturing. Sodium pyvurate works mostly  as  an additional source  energy. It also have protective effects against hydrogen peroxide.  According to my experience,  Sodium pyruvate is not necessary for differentiation. It 's not good for moving  out of the incubate when the EBs are in hanging drop situation. It should be fine to take out the plate carefully and take a simple look once they were in ultralow attachment plates. Hope this helps, Good luck!   Xiang Wang  
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 8:00 AM
  5. Thank you Xiang Wang! The cardiaomyocyte contractions became obvious after 9days. But the contraction of a certain area became weaker and finally disappeared. Is it  normal or something gŒs wrong? And how can I purify the cardiaomyocytes? How can I increase the percent of the cardiomyocytes? Thank you a lot!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2008 - 3:59 AM
  6. Dear Doctor Xiang Wang

    is necessary to add gelatin on the plate or not??

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 12, 2009 - 10:42 AM
  7. Dear Doctor Xiang Wang,

    is it possible to split the cardiomyocytes? Or how can i isolate them, to start my assays with them?
    Thank you very much.

    Kind regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 26, 2011 - 11:27 AM

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