Différenciation in vitro de souris embryonnaires souches (MES) Cellules utilisant la méthode de goutte suspendue

Biology

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Summary

Cette vidéo montre comment effectuer la différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris aux corps embryoïdes utilisant la méthode de la goutte pendante.

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Wang, X., Yang, P. In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method. J. Vis. Exp. (17), e825, doi:10.3791/825 (2008).

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Abstract

Les cellules souches ont le potentiel remarquable pour développer dans de nombreux types cellulaires différents. Quand une cellule souche se divise, chaque nouvelle cellule a le potentiel de demeurer une cellule souche ou devenir un autre type de cellule avec une fonction plus spécialisée, ce prometteur de la science est à la tête des scientifiques pour étudier la possibilité de thérapies cellulaires pour traiter la maladie. Lorsque la culture en suspension sans facteurs antidifferentiation, les cellules souches embryonnaires spontanément différencier et former en trois dimensions des agrégats multicellulaires. Ces agrégats cellulaires sont appelés corps embryoïdes (EB). Culture en suspension de chute est une méthode largement utilisée EB formation de l'induction. Le fond arrondi de la goutte suspendue permet l'agrégation des cellules ES qui peuvent fournir des cellules MES un bon environnement pour former EBS. Le nombre de cellules ES aggregatied dans une goutte suspendue peut être contrôlée en faisant varier le nombre de cellules dans la suspension cellulaire initiale à être accroché comme une goutte sur le couvercle de la boîte de Pétri. En utilisant cette méthode, nous pouvons reproductible forme homogène EB à partir d'un nombre prédéterminé de cellules ES.

Protocol

  1. Gélatiniser flacon T75 en utilisant une solution à 0,1% de gélatine et de la plaque incuber dans une 37 ° C, le CO 2 de la culture incubateur à 5% du tissu nuit un jour avant.
  2. Sortez les cellules d'incubation MES, aspirer le milieu, rincer la culture de cellules ES avec PBS, ajouter la solution de trypsine 0,05% à recouvrir le fond du plat (2 plaques ml/100mm).
  3. Incuber à 37 ° C pendant environ 1 minute, jusqu'à ce que les cellules sont desquamation de la plaque.
  4. Doucement triturer (pipette de haut en bas), les cellules trypsinisées quatre à six fois pour disperser les cellules ES avec une pipette Pasteur branché,. Transférer les cellules ES dispersés dans un tube de 15 ml à centrifuger conique contenant préchauffée (37 ° C) moyenne MES.
  5. Recueillir les cellules par centrifugation. Aspirer le surnageant, ajouter 10 ml de milieu de MES et la pipette de haut en bas pour former une suspension cellulaire unique.
  6. Transférer la suspension cellulaire dans un flacon T75 pré-enduites de gélatine à 0,1% et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant une heure

    * Après une heure, les fibroblastes ont attaché à la plaque, mais les cellules souches restent dans le milieu. Pipeter le moyen de recueillir les cellules souches.

  7. Faites tourner les cellules à 1000 rpm pendant 5 min et aspirer hors du milieu MES. Puis ajouter un autre 10 ml de milieu de différenciation MES et remettre les cellules par pipetage répétitifs jusqu'à ce qu'il semble y avoir une suspension fine de cellules.
  8. Compter les cellules avec un milieu de différenciation hémocytomètre utiliser pour diluer la suspension de cellules souches à une concentration de 400 à 500 cellules par 20ul (20ul/drop) dans un bassin de stériles.
  9. Soulevez le couvercle soigneusement l'inverser et la placer sur le dessus du plat contenant 10 ml de PBS. En utilisant une pipette multicanaux, faire des rangées de gouttes sur la surface de 20ul retroussé intérieure du couvercle de la boîte de culture tissulaire.
  10. Placez délicatement le plat dans l'incubateur pendant 2 jours. Après deux jours, soigneusement tourner sur la plaque de couverture, aspirez 180 ul moyenne de différenciation fraîche et mettre quelques gouttes dans le puits d'une plaque de 96 puits ultra attachement. Puis le micro de la goutte avec les gouttes de pipette et de transfert, un par un, à la plaque de 96 puits. Placer les plaques dans le reposer pendant 3 jours d'incubation.
  11. Enrober chaque puits d'une plaque de 48 puits de culture de tissu avec 300ul de 0,1% de gélatine. Après l'ajout de la gélatine, incuber la plaque pendant la nuit à 37 ° C un jour en avance avant le transfert de l'EBS.
  12. Le lendemain, aspirer les feuilles de gélatine de la plaque de 48 puits. Puis ajouter 300 ul de milieu de différenciation à chaque puits. Transfert l'EBS de la plaque de 96 puits aux 48 et la gélatine des plaques revêtues un par un. Changer le support le jour suivant et ensuite changer le milieu tous les autres jours pour maintenir les cellules.
  13. Spontanée contractions cardiaomyocyte devrait être évident dans les 7 jours.

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Discussion

Les inconvénients de la méthode de la goutte suspendue sont les suivants: le volume de liquide d'une baisse est limitée à moins de 50ul due au maintien de gouttes suspendues sur le couvercle par la tension de surface, et il est impossible de changer le milieu des gouttes pendantes. Observation de former EBS gouttes directement avec la microscopie est également très difficile pendant la culture. Plus loin plus, la méthode de la goutte suspendue compose de deux étapes, par conséquent, une série d'étapes de la méthode de la goutte suspendue peut être gênant.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
DMEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum(FBS) Reagent Hyclone SH30070.03
L-Glutamine Reagent GIBCO, by Life Technologies 25030
Non-Essential Amino Acids Reagent GIBCO, by Life Technologies 11140-050
Penicllin / Streptomycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
Sodium Pyruvate Reagent GIBCO, by Life Technologies 11360-70
β-mercapt–thanol Reagent Chemicon International ES-007-E
leukemia inhibitory factor(LIF) Reagent Chemicon International LIF2005
96-well ultralow attachment plate Tool Corning 3474

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References

  1. Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
  2. Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).

Comments

7 Comments

  1. Dear Doctor Xiang Wang,  your technique appear useful and very interesting. I' m studying mES and I want to differentiate them into simple embryoid bodies, but not into predefinite cells. So I have a question for you. The differentiation medium could be a stem cell medium just without LIF? Or do I need to add some elements to my medium to produce embryoid bodies? Thank you very much and best regards,  Barbara Tondelli.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 7:13 AM
  2. hi, i work together w/ xiang. he returned to china so i asked him to respond to you but in case he dŒsn't, let me answer: 1. yes. embryoid bodies can be made w/ the stem cell medium w/o lif. you need to create a voumetric clusters. this could be done using the hanging drop method or plate in cluster of cells. we have had best exerience making hanging drop. hope this helps.   phil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 12:09 PM
  3. Hello I want to know the function and concentration here of sodium pyvurate. Can the heartbeat appear in a differentiation medium without sodium pyvurate? And if the plates are taken out sometimes during the suspension culture period, dŒs it matter so much? I've been trying but no cardiocytes seemed to appear, and I cannot find the key to this. Thank you a lot!  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2008 - 3:02 AM
  4. Dear Huijun Zhu,   I use 1mM Sodium pyvurate for mESC culturing. Sodium pyvurate works mostly  as  an additional source  energy. It also have protective effects against hydrogen peroxide.  According to my experience,  Sodium pyruvate is not necessary for differentiation. It 's not good for moving  out of the incubate when the EBs are in hanging drop situation. It should be fine to take out the plate carefully and take a simple look once they were in ultralow attachment plates. Hope this helps, Good luck!   Xiang Wang  
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 8:00 AM
  5. Thank you Xiang Wang! The cardiaomyocyte contractions became obvious after 9days. But the contraction of a certain area became weaker and finally disappeared. Is it  normal or something gŒs wrong? And how can I purify the cardiaomyocytes? How can I increase the percent of the cardiomyocytes? Thank you a lot!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2008 - 3:59 AM
  6. Dear Doctor Xiang Wang

    is necessary to add gelatin on the plate or not??

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 12, 2009 - 10:42 AM
  7. Dear Doctor Xiang Wang,

    is it possible to split the cardiomyocytes? Or how can i isolate them, to start my assays with them?
    Thank you very much.

    Kind regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 26, 2011 - 11:27 AM

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