ハンギングドロップ法を用いたマウス胚性幹(MES)細胞のin vitroにおける分化

Biology

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Summary

このビデオでは、ハンギングドロップ法を用いて胚様体には、マウス胚性幹細胞のin vitroでの分化に実施する方法を示しています。

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Wang, X., Yang, P. In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method. J. Vis. Exp. (17), e825, doi:10.3791/825 (2008).

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Abstract

幹細胞は多くの異なる細胞型に開発するために驚くべき可能性を秘めている。幹細胞が分裂するとき、それぞれの新しい細胞がどちらの幹細胞を維持またはより専門的な機能を持つ細胞の別の型になる可能性を秘めている、科学のこの有望な、病気を治療するために、細胞ベースの治療の可能性を調査する科学者をリードしています。ときにantidif​​ferentiation因子のない懸濁液中の文化、胚性幹細胞は、自発的に分化し、三次元多細胞集合体を形成する。これらの細胞凝集体は、胚様体(EB)と呼ばれています。ドロップの文化を吊るすことは広く使用されているEBの形成誘導法である。ハンギングドロップの丸みを帯びた底は、EBSを形成するためのMESの細胞に良い環境を提供することができるES細胞の凝集することができます。ハンギングドロップでaggregatied ES細胞の数は、ペトリ皿の蓋からのドロップとしてハングアップしているように初期の細胞懸濁液中の細胞の数を変えることによって制御できます。このメソッドを使用して我々は、再現性ES細胞の所定の数から均質なEBSを形成することができます。

Protocol

  1. 前に37℃、5%CO 2組織培養インキュベーターで一晩一日に0.1%ゼラチン溶液とインキュベートプレートを使用してT75フラスコをゼラチン状にする。
  2. 、インキュベートからMESの細胞を取り出し、培地を吸引除去し、PBSでES細胞培養をすすぎ、皿のコート底を(2 ml/100mmプレート)に0.05%トリプシン溶液を加える。
  3. 細胞がプレートを脱却するまで、37℃で約1分間インキュベートする。
  4. 静かに、接続されてパスツールピペットを持つES細胞を分散させるために4〜6回(ピペットの上下)トリプシン処理細胞をひいて粉にする。温めておいた(37℃)MESの培地を含む15 mlのコニカル遠心チューブに分散したES細胞を移す。
  5. 遠心分離により細胞を収集する。 、上清を吸引するMESの培地10mlを追加し、単一の細胞懸濁液を形成するために上下にピペッティング。
  6. 37℃で0.1%のゼラチンおよびインキュベーションをプレコートT75フラスコに細胞懸濁液を移す℃で1時間5%CO 2

    * 1時間後、線維芽細胞はプレートに取り付けられているが、幹細胞は、培地中に残ります。幹細胞を収集するための培地をピペッティング。

  7. 5分間1000rpmで細胞をスピンし、MESの培地をオフに吸引除去する。その後、MESの分化培地の別の10 mlを追加したり、セルの微細な懸濁液があるように表示されるまで、反復的なピペッティングにより細胞を再懸濁します。
  8. 滅菌流域における20ul(20ul/drop)あたり400〜500細胞の濃度に幹細胞懸濁液を希釈するために血球計算板の使用の分化培地で細胞をカウント。
  9. 蓋を持ち上げ、慎重にそれを反転し、10mlのPBSを含む皿の上に置きます。マルチチャンネルピペットを使用して、組織培養皿の蓋の上から転身内面に20ul滴の行を作る。
  10. 慎重に2日間インキュベーターで皿を置きます。 2日後、慎重に、プレートカバーをめくり180 ulの新鮮な分化培地を吸引し、96ウェル超低アタッチメントプレートのウェルに数滴を入れて。その後ピペットと転送滴、一人ずつ、96ウェルプレートへとピックアップドロップを。 3日間静インキュベーターにプレートを置きます。
  11. コー​​ト0.1%ゼラチンの300ulと48ウェル組織培養プレートの各ウェルに。 EBSを転送する前にゼラチンを添加した後、℃、一日前に37℃で一晩インキュベートする。
  12. 翌日、48ウェルプレートからゼラチンを吸引除去する。次に、各ウェルに分化培地の300 ulを加える。 96ウェルプレートから48ウェルゼラチンコートプレート一つずつにEBSを転送する。翌日培地を変更してから細胞を維持するために一日おきに培地を変更してください。
  13. 自発cardiaomyocyte収縮は7日以内に明らかにする必要があります。

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Discussion

滴の液量は、表面張力によって蓋の上にぶら下がって降下を維持するために以下50ULに限定されており、それがドロップを干すための培地を変更することは不可能だ:ハンギングドロップ法の短所は次のとおりです。顕微鏡で直接滴でEBSを形成するの観察は、栽培中にも非常に困難である。さらにもっと、ハンギングドロップ法は、次の2つの手順で構成され、従って、ハンギングドロップ法のステップのシリーズは、面倒かもしれません。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
DMEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum(FBS) Reagent Hyclone SH30070.03
L-Glutamine Reagent GIBCO, by Life Technologies 25030
Non-Essential Amino Acids Reagent GIBCO, by Life Technologies 11140-050
Penicllin / Streptomycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
Sodium Pyruvate Reagent GIBCO, by Life Technologies 11360-70
β-mercapt–thanol Reagent Chemicon International ES-007-E
leukemia inhibitory factor(LIF) Reagent Chemicon International LIF2005
96-well ultralow attachment plate Tool Corning 3474

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References

  1. Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
  2. Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).

Comments

7 Comments

  1. Dear Doctor Xiang Wang,  your technique appear useful and very interesting. I' m studying mES and I want to differentiate them into simple embryoid bodies, but not into predefinite cells. So I have a question for you. The differentiation medium could be a stem cell medium just without LIF? Or do I need to add some elements to my medium to produce embryoid bodies? Thank you very much and best regards,  Barbara Tondelli.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 7:13 AM
  2. hi, i work together w/ xiang. he returned to china so i asked him to respond to you but in case he dŒsn't, let me answer: 1. yes. embryoid bodies can be made w/ the stem cell medium w/o lif. you need to create a voumetric clusters. this could be done using the hanging drop method or plate in cluster of cells. we have had best exerience making hanging drop. hope this helps.   phil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 12:09 PM
  3. Hello I want to know the function and concentration here of sodium pyvurate. Can the heartbeat appear in a differentiation medium without sodium pyvurate? And if the plates are taken out sometimes during the suspension culture period, dŒs it matter so much? I've been trying but no cardiocytes seemed to appear, and I cannot find the key to this. Thank you a lot!  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2008 - 3:02 AM
  4. Dear Huijun Zhu,   I use 1mM Sodium pyvurate for mESC culturing. Sodium pyvurate works mostly  as  an additional source  energy. It also have protective effects against hydrogen peroxide.  According to my experience,  Sodium pyruvate is not necessary for differentiation. It 's not good for moving  out of the incubate when the EBs are in hanging drop situation. It should be fine to take out the plate carefully and take a simple look once they were in ultralow attachment plates. Hope this helps, Good luck!   Xiang Wang  
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 8:00 AM
  5. Thank you Xiang Wang! The cardiaomyocyte contractions became obvious after 9days. But the contraction of a certain area became weaker and finally disappeared. Is it  normal or something gŒs wrong? And how can I purify the cardiaomyocytes? How can I increase the percent of the cardiomyocytes? Thank you a lot!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2008 - 3:59 AM
  6. Dear Doctor Xiang Wang

    is necessary to add gelatin on the plate or not??

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 12, 2009 - 10:42 AM
  7. Dear Doctor Xiang Wang,

    is it possible to split the cardiomyocytes? Or how can i isolate them, to start my assays with them?
    Thank you very much.

    Kind regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 26, 2011 - 11:27 AM

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