Na diferenciação in vitro de rato-tronco embrionárias (MES) células usando o método da gota de suspensão

Biology

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Summary

Este vídeo demonstra como realizar a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias de camundongos para corpos embrióides usando o método da gota pendente.

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Wang, X., Yang, P. In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method. J. Vis. Exp. (17), e825, doi:10.3791/825 (2008).

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Abstract

Células-tronco têm o extraordinário potencial de se transformar em vários tipos de células diferentes. Quando uma célula-tronco se divide, cada nova célula tem potencial para ou manter uma célula-tronco ou se tornar um outro tipo de célula com uma função mais especializada, esta promissora da ciência é levando os cientistas a investigar a possibilidade de terapias baseadas em células para tratar a doença. Quando a cultura em suspensão sem fatores antidiferenciação, células-tronco embrionárias espontaneamente diferenciar e forma tridimensional agregados multicelulares. Esses agregados celulares são chamados corpos embrióides (EB). Hanging cultura queda é amplamente utilizado EB método de indução de formação. O fundo arredondado de gota em suspensão permite a agregação de células-tronco embrionárias, que podem fornecer células MES um bom ambiente para a formação de EBs. O número de células ES aggregatied em uma gota em suspensão pode ser controlado variando o número de células em suspensão de células inicial para ser pendurado como uma queda da tampa da placa de Petri. Usando esse método, podemos reproducibly forma homogênea EBs de um número predeterminado de células-tronco embrionárias.

Protocol

  1. Gelatinizar T75 frasco com uma solução 0,1% de gelatina e placa de incubação em 37 ° C 5% CO, 2 de cultura de tecidos incubadora durante a noite um dia antes.
  2. Retire as células MES de incubação, aspirar o médio, lavar a cultura de células ES com PBS, adicione solução de tripsina 0,05% para revestir o fundo do prato (2 placa ml/100mm).
  3. Incubar a 37 ° C por aproximadamente 1 minuto, até que as células são sloughing fora do prato.
  4. Suavemente triturar (pipeta cima e para baixo) as células tripsinizados quatro a seis vezes para dispersar as células ES com uma pipeta Pasteur ligado,. Transferência das células ES dispersos em um tubo de centrífuga de 15 ml cônico contendo pré-aquecido (37 ° C), médio MES.
  5. Coletar células por centrifugação. Aspirar o sobrenadante, adicionar 10 ml de meio de MES e pipeta cima e para baixo para formar uma suspensão única célula.
  6. Transferir a suspensão celular para um balão T75 pré-revestido com 0,1% de gelatina e incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 por uma hora

    * Depois de uma hora, os fibroblastos ter anexado à placa, mas as células-tronco permanecem no meio. Pipeta até o meio para coletar as células-tronco.

  7. Girar as células a 1000 rpm por 5 min e aspire o meio off MES. Em seguida, adicione 10 ml de uma outra MES médio diferenciação e ressuspender as células por pipetagem repetitiva, até parece haver uma suspensão fina de células.
  8. Contagem de células com um meio de diferenciação hemocitômetro usar para diluir a suspensão de células-tronco a uma concentração de 400 a 500 células por 20ul (20ul/drop) em uma bacia estéril.
  9. Levante a tampa, cuidadosamente invertê-lo e colocá-lo em cima do prato contendo 10 ml de PBS. Usando uma pipeta multicanal, fazer linhas de gotas 20ul na superfície até que virou interna da tampa do prato de cultura de tecidos.
  10. Cuidadosamente coloque o prato na incubadora por dois dias. Depois de dois dias, cuidadosamente vire a placa de cobertura, aspirado 180 médias diferenciação ul fresco e colocar algumas gotas para dentro do poço de uma placa de fixação de 96 poços ultralow. Em seguida, pegar a queda das gotas da pipeta e transferir, um por um, para a placa de 96 poços. Coloque as placas na incubadora sem ser perturbado por 3 dias.
  11. Casaco de cada poço de uma placa de 48 poços de cultura de tecidos com 300ul de 0,1% de gelatina. Depois de adicionar a gelatina, incubar a placa durante a noite a 37 ° C um dia antes antes da transferência o EBS.
  12. No dia seguinte, aspire a gelatina a partir da placa de 48 também. Em seguida, adicionar 300 ul do meio de diferenciação para cada poço. Transferir os EBs dos 96 pratos bem aos 48 bem gelatina revestido placas de um por um. Mudar o meio do dia seguinte e depois mudar o meio em dias alternados para manter as células.
  13. Contrações espontâneas cardiaomyocyte deveria ser evidente dentro de 7 dias.

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Discussion

As desvantagens do método de gota em suspensão são as seguintes: o volume de líquido de uma queda é limitado a menos de 50uL, devido à manutenção de gotas de suspensão na tampa pela tensão superficial, e é impossível mudar o meio para pendurar gotas. Observação da formação de EBs em gotas diretamente com microscopia também é muito difícil durante o cultivo. Ainda mais, o método de gota em suspensão consiste em duas etapas, portanto, uma série de etapas do método de gota em suspensão pode ser problemático.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
DMEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum(FBS) Reagent Hyclone SH30070.03
L-Glutamine Reagent GIBCO, by Life Technologies 25030
Non-Essential Amino Acids Reagent GIBCO, by Life Technologies 11140-050
Penicllin / Streptomycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
Sodium Pyruvate Reagent GIBCO, by Life Technologies 11360-70
β-mercapt–thanol Reagent Chemicon International ES-007-E
leukemia inhibitory factor(LIF) Reagent Chemicon International LIF2005
96-well ultralow attachment plate Tool Corning 3474

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
  2. Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).

Comments

7 Comments

  1. Dear Doctor Xiang Wang,  your technique appear useful and very interesting. I' m studying mES and I want to differentiate them into simple embryoid bodies, but not into predefinite cells. So I have a question for you. The differentiation medium could be a stem cell medium just without LIF? Or do I need to add some elements to my medium to produce embryoid bodies? Thank you very much and best regards,  Barbara Tondelli.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 7:13 AM
  2. hi, i work together w/ xiang. he returned to china so i asked him to respond to you but in case he dŒsn't, let me answer: 1. yes. embryoid bodies can be made w/ the stem cell medium w/o lif. you need to create a voumetric clusters. this could be done using the hanging drop method or plate in cluster of cells. we have had best exerience making hanging drop. hope this helps.   phil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 12:09 PM
  3. Hello I want to know the function and concentration here of sodium pyvurate. Can the heartbeat appear in a differentiation medium without sodium pyvurate? And if the plates are taken out sometimes during the suspension culture period, dŒs it matter so much? I've been trying but no cardiocytes seemed to appear, and I cannot find the key to this. Thank you a lot!  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2008 - 3:02 AM
  4. Dear Huijun Zhu,   I use 1mM Sodium pyvurate for mESC culturing. Sodium pyvurate works mostly  as  an additional source  energy. It also have protective effects against hydrogen peroxide.  According to my experience,  Sodium pyruvate is not necessary for differentiation. It 's not good for moving  out of the incubate when the EBs are in hanging drop situation. It should be fine to take out the plate carefully and take a simple look once they were in ultralow attachment plates. Hope this helps, Good luck!   Xiang Wang  
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 8:00 AM
  5. Thank you Xiang Wang! The cardiaomyocyte contractions became obvious after 9days. But the contraction of a certain area became weaker and finally disappeared. Is it  normal or something gŒs wrong? And how can I purify the cardiaomyocytes? How can I increase the percent of the cardiomyocytes? Thank you a lot!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2008 - 3:59 AM
  6. Dear Doctor Xiang Wang

    is necessary to add gelatin on the plate or not??

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 12, 2009 - 10:42 AM
  7. Dear Doctor Xiang Wang,

    is it possible to split the cardiomyocytes? Or how can i isolate them, to start my assays with them?
    Thank you very much.

    Kind regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 26, 2011 - 11:27 AM

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