Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Published 8/15/2008
11 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Это видео демонстрирует технику микроинъекции в гонаде C. Элеганс для создания трансгенных животных.

Cite this Article

Copy Citation

Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Трансгенные Caenorhabditis Элеганс может быть легко создан с помощью микроинъекции ДНК плазмиды раствора в гонады 1. ДНК плазмиды перестраивает сформировать внехромосомными concatamers, которые стабильно наследуются, хотя и не с такой же эффективностью, как фактическое хромосомы 2. Интересующего гена совместно вводили очевидным фенотипических маркеров, таких как РОЛ-6 или GFP, чтобы отбор трансгенных животных при вскрытии микроскопом. Экзогенного гена может быть выражена от его родного промоутер для сотовых исследования локализации. Кроме того, трансгенов может быть вызвано различными тканеспецифические промоутер для оценки роли продукта гена в данной клетки или ткани. Этот метод эффективно диски экспрессии генов во всех тканях C. Элеганс, за исключением половых или раннего эмбриона 3. Создание трансгенных животных широко применяется для целого ряда экспериментальных парадигм. Это видео демонстрирует микроинъекции процедуры для создания трансгенных червей. Кроме того, подбор и обеспечение стабильной трансгенных C. Элеганс линии описывается.

Protocol

Выражение плазмиды Строительство

Два плазмид требуются: одна для тканеспецифические экспрессии гена интересов и второй, как селективный маркер трансформации.

Экспериментальные плазмиды

  1. Выберите промоутер, что выражается в ткани / элемент тип интереса, например, нерва или мышцы конкретных промоутера. Если кто-то выразить нескольких генов в той же ткани, промоутер кассету плазмиды в шлюзе системы (Invitrogen) могут быть использованы. Такой подход позволяет вставлять любой ген интереса ниже по течению от промотора рекомбинационной 4 клонирования. Правило, 2-5 кб предшествующих последовательностей достаточно иметь правильные и точные выражения.

  2. КДНК гена может быть клонирован двумя способами:
    1. Обычные клонирования использованием ферментов рестрикции.
    2. Для клонирования шлюз, это ПЦР усиливается использованием праймеров, содержащих шлюз ATT B рекомбинационной последовательности. Усиливается кДНК первой объединить в pDONR201 доноров вектора, чтобы создать запись вектор, а затем превращается в E. палочки штамма DH5a. После выбора успешных рекомбинантов и мини-приготовительные изолирования ДНК, вступление вектор объединить в промоутер содержащих назначения вектор для создания выражения плазмиды. Подробности о рекомбинационной клонирования можно получить либо ручной шлюз Invitrogen или в Колдуэлл и соавт. 5.

Выбор Маркера плазмиды

Примеры трансгенных плазмид маркер включают РОЛ-6 или использование мышц стенки тела промоутер UNC-54 для управления флуоресцентными экспрессии белка. Эти плазмиды маркера, как правило, доступны из научно-исследовательского сообщества по запросу.

Микроинъекции Элеганс C.

Подготовка

  1. Выполните выделения ДНК из двух плазмид, которые должны быть введены. Количественно их и смешать в соотношении 1:1 на 50 нг / мкл.

  2. Подготовка агара лап:
    1. Сделайте 2% агарозном раствора в воде, тепло или микроволновой печи до полного растворения.
    2. Изложить несколько 22 х 50 мм стекла крышка на настольный.
    3. С помощью пипетки Пастера, поместите каплю расплавленной агарозы на одной обложкой стекло и сразу же место второй стакан крышку над падение на 90 углом к ​​первой. Повторите несколько других стекол крышку. Диаметр уплощенной диск агарозы должна быть в пределах 15-20 мм.
    4. После агарозном укрепил (это займет всего моментов), снимите крышку стекла и позволяют площадку высохнуть полностью (несколько часов, чтобы на ночь).
    5. Хранить прокладки в окно стеклянной крышкой при комнатной температуре.

  3. Сделать иглы погрузчиков ДНК решение:

    Иглы погрузчики создаются из 100 мкл капиллярной трубки, которые нагреваются в среднем на открытом огне и быстро вытащил примерно в два раза их длины. Две половинки привязываются друг от друга раз капиллярная трубка охлаждается. Запасами 10-20 иглы погрузчики для инъекций. Магазин в вертикальном положении в стойку трубки микроцентрифужных. Будьте осторожны, чтобы не прокалывать себе на очки.

  4. Сделать микроинъекции игл:

    Игла изготовлена ​​из специального капилляра, который содержит внутренние нити стекла, нити этого служит фитиля для раствора ДНК. Эти тянут на иглу-съемник машины. Мы используем Narishige PP-830 Съемник с тепловой установки 24.8. Некоторые иглы потянул время и хранятся в небольшой пластиковой коробке. Несколько иглы могут быть легко «установлена» на полосу пластилин для долгосрочного хранения.

  5. Иглы "выключатели":

    Кончике иглы микроинъекции вытягивается так хорошо, что это фактически закрыта в конце этого и должен быть взломан с помощью небольших осколков покровного стекла. Эти подготовленные упаковки 18 х 18 мм защитное стекло в бумажное полотенце и осторожно нажимая пока он разбивается на несколько частей. Осколки полезных размер примерно 3 х 4 мм.

  6. Расти дикого типа (N2) червей ранней стадии взрослой для инъекций с использованием стандартных процедур 6. Подготовка около 100 правильно поставил черви / построить вводили.

Процедура

  1. Откройте основной клапан на бак гелия, который подключен к руке микроинъекции иглой и держателем. Закройте регулирующий клапан, чтобы газ, чтобы войти в линию, в результате чего давление до 35 атм. Обратите внимание, что газ может быть выпущен использованием педали.

  2. Вставьте иглу погрузчика в стандартной трубы pipetter рот (находится в контейнерах стеклянные капилляры) и составить небольшое количество смеси плазмиды (~ 1 мкл).

  3. Иглы погрузчика осторожно помещают в задней части инъекционной иглы и аккуратно вставляется весь путь до конца длинуиглу, пока не почувствуете сопротивление. Выгнать раствора ДНК, мягко дует, а затем удалить загрузчик.

  4. Вставьте иглу в микроинъекции руку, стараясь, чтобы поместить его в небольшой внутренний резиновую прокладку.

  5. Место иглы нарушение осколок покровного стекла на одном краю агар площадку. Обложка осколок, а также всей поверхности агара площадку, с галоидоуглеводородов нефти. Место агар накладка на стадии инвертированного микроскопа.

  6. Расположите иглу в центр поля зрения использования 4X объективных и яркое освещение поля, но до сих пор не опустите его в масло. Кроме того, положение внутреннего края осколок покровного стекла в центре, затем сосредоточиться на нем (еще используют 4X цель). Опустите иглу в нефти, приведение его в той же фокальной плоскости, как осколок покровного стекла. Поднимите увеличение за счет перехода на 40Х цели. Переориентация на краю осколка и положение кончика иглы, если это необходимо.

  7. Чтобы открыть до кончика инъекционной иглой, осторожно подталкивать иглу к краю покровного стекла осколок, и в то же время применение короткого импульса газа через ножную педаль. Иглы будет достаточно взломан, когда маленькие капельки жидкости побега конце иглы. Избыток жидкости потока из-за слишком большого открытия не желательно, так как он будет убивать животных.

  8. Удалить агар площадку со сцены, поднимая иглу, но не меняют X-или Y-ось позиции. Слайд этапе из-под иглы, удалить агар площадку и разместить его на вскрытии микроскопом. Передача червя на панель, ниже поверхности нефти. Если червь извивается, нежно поглаживать его, пока он контактов агар площадку. Влажной червь должен придерживаться сухой агарозы.

  9. Инъекция
    1. Быстро место обратно агар площадку на сцену, центрирования червя в поле зрения.
    2. Опустите иглу в той же плоскости, в фокусе, как червь.
    3. Переключатель фильтров для освещения Хоффман (тип контраста фильтра). Это позволяет морфологическая деталь червя становятся видимыми. Если Номарского / DIC оптики можно найти на перевернутый масштаб, который будет работать также. Использование 40X цели, сосредоточиться на "зернистым" синцитиальный центре червь гонады, ниже "сотовый" узор ростка ядер (выбрать в зависимости от того гонады расположен на стороне червя перед иглой).
    4. Точная настройка положения иглы до кончика также находится в фокусе (той же плоскости, гонад "зернистости").
    5. Осторожно введите иглу в центре гонады и применять короткого импульса давления газа изгнать капля или две ДНК в гонады руку. Вы должны наблюдать волну жидкости распределены по дистальной гонады. Не думайте, что больше жидкости, лучше, так как слишком много жидкости может поступать в проксимальных изгиб гонады руки, которые могут закрыть ооцитов производства. Если это возможно, в зависимости от положения червя, ввести другую руку гонады в том же порядке.
    6. Важно, чтобы работать быстро, в результате употребления инъекционных червя, так как она может легко пересушивает. Решение придать второе плечо гонад зависит от того, насколько быстро вы можете повторно положение иглы и червя. Весь процесс в идеале должны принимать не более 1-2 минут.

  10. Снимите крышку стекла со сцены и поместите его на вскрытии области. Применять 1 мкл М9 буфера (22 мм KH 2 PO 4, 42мм Na 2 HPO 4, 85 мм NaCl, 1 мМ MgSO 4) непосредственно на вводили червя (это может повлечь за собой погружение кончика пипетки от поверхности галоидоуглеводородов нефти). Буфер должен увлажняет червя, он будет плавать от поверхности агарозном площадку. Передача червя регулярные пластины с использованием червя выбор. Площадку агарозы можно повторно использовать еще несколько раз, пока не стало слишком насыщенным буфера и червей не придерживаться.

Трансгенные выбор

  1. Введенный червей, P 0 поколения, перечисляемых на индивидуальные свежие, бактериально посеяны пластины (60 мм) и позволила воспроизвести. Как правило, вводят животным инкубируют при 20 ° С в течение 2-3 дней, пока потомство появится.

  2. F 1 потомства наблюдаются на наличие трансгенной маркер (например, флуоресценции) при помощи флуоресцентного стереомикроскопа. Каждый люминесцентные, перевозчик F 1, животное отдельно клонирована на новую пластинку (так как потомство от каждого F 1 рассматриваются различные линии). F 1 гермафродитов допускаются к размножению. Опять же, это, как правило, осуществляется на при 20 ° С в течение 2-3 дней, пока потомство появится.

  3. F 2 поколения наблюдается у трансгенных животных, а также. F 2 животных, которые унаследовали и выразить трансгенных массива считаются «стабильный» линии.

    ПРИМЕЧАНИЕ: В F 1-йвозраст может быть много трансгенных животных, но они не являются стабильными. Большинство F 1 трансгенных животных, не будут распространяться на F 2 устойчивых линий.

    ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля за изменчивости числа копий гена, создавать не менее трех независимых стабильных линий на построить вводили.

  4. Каждый независимый стабильный линия должна быть сохранена в качестве отдельной строкой червей. Каждая строка может распространяться путем передачи нескольких трансгенных животных для новой пластинкой в ​​каждом поколении, что должно быть выполнено с использованием флуоресцентного стереомикроскопа если выбор маркера флуоресцентные.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

При выполнении этой процедуры, важно помнить, чтобы:
- Вводят непосредственно в центре гонады
- Не вводить слишком много жидкости
- Работать быстро, чтобы предотвратить высыхание.

Если у вас возникли проблемы с иглой, такие, как он сломан слишком большой, то лучше переделать свежей иглы, а не пытаться внедрить с далеко не идеальным иглы.

Поколение трансгенных червей имеет множество применений, таких как:
- Выявление мутантных генов, в метод преобразования спасения
- Отображение белковых доменов через выражение усеченного белков
- Характеристика роли генов в клеточных и болезненные процессы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Мы хотим отметить дух сотрудничества всех членов Колдуэлл Lab. Двигательные расстройства исследования в лаборатории была поддержана Бахман-Стросс дистонии и Паркинсона фонд, Соединенные Паркинсона Фонда, американский Паркинсона Болезнь ассоциации, Болезнь Паркинсона Ассоциации Алабама, Майкл Дж. Фокс Фонд исследований болезни Паркинсона, и Undergraduate Research.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef Hulle 10S elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm Fisher Scientific 12-548-A
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Coverglass 22x50 mm Fisher Scientific 12-545-E
100 ul Capillary VWR international 53432-921
Glass Capillary for Needles "Kwik-Fil" World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Needle Puller Tool Narishige International Model PP-830
microINJECTOR System Tritech Research, Inc. MINJ-1000 Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  2. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  3. Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
  4. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Comments

11 Comments

  1. Dear Dr. Laura A,   I am very much interested to work with you as a Researcher. Regarding myself, I would like to inform you that I did my Ph.D. degree from the Faculty of Science, Hiroshima University, Japan. I completed my M.Phil. M.Sc. and B.Sc. (Honours) degree from the University of Rajshahi, Bangladesh. Now I am working on toxic response and behavior of C. elegans as a postdoctoral researcher at Pusan National University, S. Korea.    I would be glad if you would kindly accept me as a Researcher in your Laboratory and provide me a fellowship or any financial support.   I look forward to your kind reply at your earliest convenience.   With best regards   Sincerely yours, Dr. M. Golam Mortuza Present Address Postdoctoral Researcher Lab of Ecology and Behavior System Division of Biological Sciences Pusan National University Busan 609-735, S. Korea E-mail: mortuzaru@yahoo.com   Permanent Address Professor Department of Zoology Rajshahi University Rajshahi 6²05, BANGLADESH E-mail: mortuza@ru.ac.bd

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 2:41 AM
  2. Hi, i am learning microinjection in C. elegans and am having problems recovering the worms.  They seem to recover fine initially and are thrashing around in the buffer on the plate, but after a day when I look back they have all died on the plate where they were placed.  I don't know what is wrong, do you have any suggestions? Thanks. Jane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 22, 2009 - 1:57 PM
  3. Dear Jane,
    Death post injection is likely from two causes. The first is that the worms spent too much time stuck down on the agar pad before being hydrated off. Often they will be alive (barely) but then die. Reducing the time they spend stuck down will stop this source of death. As you become more adept and quicker with the process this will improve. The second cause of post injection death is from the worm getting stabbed too much- either from being injected in the wrong place (intestine), being injected too deeply (the &#x²01C;shish-kabob&#x²01D; mistake) or using too big of a needle. Often one can tell if this is the problem when the next day the injected worm has exploded out its guts. Make sure you are using a very tiny, fine tip in the needle and only barely enter under the cuticle into the gonad. Again these will improve with practice.

    One last thought- when you transfer the worm from the injection pad to the plate sometimes oil comes along with it. Gently move the worm out from the oil droplet onto the food. This will help it recover.
    Good luck!

    Laura

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 1:18 PM
  4. Hi Laura,
    Thanks so much for replying to my message. I think my problem is that I am always injecting in the wrong place. Occasionally they explode after injection, in which case I know I have injected too much or stabbed too much. My needle is very fine and is penetrating quite easily but only every once in a while dŒs it look like I have hit the gonad. I am trying to line it up so that I can see the nuclei on either side, but I still seem to miss most of the time. It mostly seems to be in the body of the worm. Do you have any tips for how I can improve my accuracy of hitting the gonad?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 3:20 PM
  5. Dear Jane,
    I was trying to figure out how to help you visualize exactly where to inject. Here are some additional pointers and details from the video.

    I discuss how the dead center best spot for injecting is in the grainy interior of the gonad. Depending on your optics this may be very faint and hard to see. This graininess is like sand compared to the &#x²01C;pebble&#x²01D;-like appearance of the intestine. The gonad interior has also been described as a fine &#x²01C;velvetly&#x²01D; texture.

    If you go back and watch the video at time 8:08 that worm is a little too dry- see how the embryos (which don&#x²019;t dry out) are standing out more.
    In frame 8:²7 a nice view of the gonad with the arrow is shown. You can see an impression of the germ nuclei, but the &#x²01C;graininess&#x²01D; isn&#x²019;t too visible.
    Starting at 8:4² there is also a nice view of the animal and its major features. The lower left portion curving up towards the left is intestine. On the upper side moving towards the right are oocytes from the distal arm of the gonad. In the middle, between the oocytes and the intestine, lies a view of the proximal gonad exactly where it should be injected. At 8:53 the needle seems to be positioned correctly but what you see upon injection is the oocytes expanding outward, indicating that the needle tip wasn&#x²019;t positioned properly.
    At 9:06 shows a perfect gonad hit.

    Also, I try (if possible) to position the worm such that I am injecting closer to parallel to the worm rather than perpendicular to it. The force needed to puncture the cuticle when coming in at a 90o angle to the long axis of the worm is higher and results in a greater chance of going through into the intestine or even &#x²01C;shish-kabob&#x²01D;. I usuall try to position the worm and the needle at 15-30o angles to each other. For example see 8:53 & 9:06 (preferred) vs 8:57

    Hope these will help you.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    June 15, 2009 - 11:47 AM
  6. Hello!

    I am currently designing an automated system for c.elegans injections that involves circulating worms through microchannel in a PDMS chip and positioning them for injection from a microneedle. One of the important aspects of our design is to fabricate microneedles which can more easily puncture the worm's cuticle due to smaller needle size.

    However, we have been unable to find any reference, print or electronic, that has measured the force needed to puncture the worm. This force is important in choosing how thin our needles can be, and of course the force dŒs vary with needle tip size. We may need to experimentally determine this "puncture strength" ourselves as the first to ever do so, but I am wondering if you might know of anyone who has measured similar parameters that we can at least get a ballpark place to start.

    Thanks so much!

    -- Andrew

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 5:52 PM
  7. Andrew,

    We are not aware of the type of precise information on puncture strength or penetration forces required for C. elegans, as we are molecular biologists, but your question reminded me of a method I remembered (and once tried without success) from the late 1990s. The technology you describe is likely much improved or can be. Check out this paper and maybe contact the authors regarding your question.

    Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.
    Hashmi S, Ling P, Hashmi G, Reed M, Gaugler R, Trimmer W.
    Biotechniques. 1995 Nov;19(5):766-70.

    Best of luck with your experiments. If you are ever interested in us to beta-test something as collaborators, please let us know.

    Guy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 8:38 PM
  8. Hello,

    I am currently trying to inject double stranded DNA as an alternative approach to do tissue specific knockdown. I am following a protocol in which DNA sense and antisense fused to tissue specific promoter are injected together with a marker. According to the protocol, I should inject the PCR product directly and at the concentration of 100 ng/ul. However, when I injected this mixture into the gonad, most of the worms don't survive more than one day, which is not the case with the normal injection for generating the transgenic line.

    DŒs someone have any experience with this and can suggest me something that I should change or incorporate in my protocol to make the injection work?

    Thanks before,
    Yemima

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 6, 2011 - 12:21 PM
  9. We would like to start doing microinjections in our lab and I am would like to know where you acquired the halocarbon oil. In the Wormbook microinjection protocol, Series 700 Halocarbon oil from Halocarbon Products in NJ was used. Do you know how this compares to the Voltalef halocarbon oil that you used?

    Thank you very much for your help and for the wonderful instructional video!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 13, 2013 - 1:40 PM
  10. Dear Erin,
    We no longer can get the Voltalef oil and have too switched to using Halocarbon oil 700 (but ours is from Sigma). It is a bit thinner than the Voltalef, but it works as well, if not even a little better. Glad you like the video. Good luck with the injections. --Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    March 13, 2013 - 2:59 PM
  11. Thank you so much!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 17, 2013 - 11:51 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats