توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Published 8/15/2008
11 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

هذا الفيديو يوضح أسلوب microinjection في الغدد التناسلية من ايليجانس جيم لخلق حيوانات معدلة وراثيا.

Cite this Article

Copy Citation

Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يمكن أن يكون وراثيا ايليجانس انواع معينة بسهولة عن طريق إنشاء microinjection حل DNA البلازميد في 1 التناسلية. ال DNA البلازميد يتشكل من جديد إلى النموذج concatamers خارج الصبغي التي ورثت ستابلي ، وإن لم يكن بنفس الكفاءة كما الكروموسومات الفعلي 2. والمورثة ذات الاهتمام المشترك مع حقن علامة an المظهري واضحة ، مثل رول أو GFP - 6 ، للسماح للاختيار من الحيوانات المعدلة وراثيا تحت المجهر تشريح. ويمكن التعبير عن هذا الجين الخارجية من المروج الأصلي للدراسات توطين الخلوية. بدلا من ذلك ، يمكن أن تكون مدفوعة من قبل التحوير المروج مختلف الأنسجة محددة لتقييم دور الجينات في منتج معين أو تلك الخلية الأنسجة. هذه التقنية محركات بكفاءة التعبير الجيني في جميع أنسجة ايليجانس جيم باستثناء الجنين أو أوائل germline 3. ويستخدم على نطاق واسع من الحيوانات المعدلة وراثيا إنشاء لمجموعة من النماذج التجريبية. هذا الفيديو يوضح الإجراء microinjection لتوليد الديدان المعدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك ، وصفت اختيار وصيانة خطوط مستقرة جينيا ايليجانس جيم.

Protocol

البناء التعبير البلازميد

مطلوبة البلازميدات اثنين : واحد للانسجة محددة التعبير عن الجينات في المصالح ، والمرتبة الثانية من حيث اختيار علامة التحول.

التجريبية البلازميد

  1. حدد المروج التي يعبر عنها في نوع النسيج / خلية من الاهتمام ، على سبيل المثال ، او العصب العضلات الخاصة المروج. إذا كان واحد هو التعبير عن جينات متعددة داخل النسيج نفسه ، ويمكن استخدام شريط المروج البلازميد في النظام عبارة (Invitrogen). هذا النهج يسمح للالإدراج في أي من الجين المصب مصلحة المروج بنسبة 4 الاستنساخ تهجيني وعموما ، 2-5 كيلو بايت من متواليات المنبع يكفي أن يكون تعبيرا صحيحا ودقيقا.

  2. ويمكن استنساخ [كدنا] من الجينات ذات الاهتمام بطريقتين :
    1. الاستنساخ التقليدية باستخدام إنزيمات التقييد.
    2. عبارة عن الاستنساخ ، هو تضخيم PCR باستخدام بادئات التي تحتوي على تسلسل عبارة B ATT تهجيني. هو معاد لأول مرة [كدنا] تضخيم في pDONR201 المانحة لإنشاء ناقلات ناقلات دخول ثم تحولت إلى E. القولونية سلالة DH5a. بعد اختيار recombinants ناجحة وصغيرة من الحمض النووي الإعدادية العزلة ، هو معاد للناقلات دخول ناقلات الوجهة التي تحتوي على مروج لإنشاء التعبير البلازميد. تفاصيل حول الاستنساخ تهجيني تتوفر إما من دليل أو في عبارة Invitrogen كالدويل وآخرون 5.

اختيار ماركر البلازميد

أمثلة على البلازميدات علامة المعدلة وراثيا تشمل رول - 6 أو استخدام العضلات المروج الجسم الجدار UNC - 54 إلى محرك الفلورسنت بروتين تعبير. هذه علامة البلازميدات عادة ما تكون متاحة من داخل الأوساط البحثية عند الطلب.

Microinjection من ايليجانس جيم

إعداد

  1. أداء العزلة الحمض النووي للالبلازميدات اللذين يتم ليتم حقنه. Quantitate منهم وتخلط معا في نسبة 1:1 من كل نانوغرام / 50 ميكرولتر.

  2. إعداد منصات أجار :
    1. جعل الحل agarose 2 ٪ في الماء ، الحرارة أو الميكروويف حتى المنحل.
    2. المبينة عدة تغطي 22 × 50 مم النظارات على الفوق.
    3. باستخدام ماصة باستور ، ضع نقطة من agarose ذاب على الزجاج غطاء واحد ومكان على الفور الزجاج غطاء الثاني على الهبوط بزاوية 90 إلى الأول. تكرار للعديد من النظارات تغطية أخرى. ينبغي أن قطر القرص بالارض من agarose يكون بين 15-20 ملم.
    4. بعد agarose وقد عززت (وهذا يستغرق سوى لحظات) ، وإزالة غطاء زجاجي ، والسماح للسادة في الهواء الجاف تماما (عدة ساعات ليلة وضحاها).
    5. تخزين منصات في غطاء صندوق زجاجي في درجة حرارة الغرفة.

  3. جعل إبرة لوادر حل الحمض النووي :

    يتم إنشاؤها لوادر إبرة من الأنابيب الشعرية 100 ميكرولتر التي يتم تسخينها في وسط أكثر من اللهب المكشوف وانسحبت بسرعة لمدة ما يقرب من مرتين. وقطعت شطري عدا مرة واحدة في الأنابيب الشعرية يبرد. مخزون وادر إبرة للحقن 10-20. مخزن تستقيم في microcentrifuge الرف الأنبوب. توخي الحذر حتى لا أسعد نفسه على نقطة.

  4. جعل الإبر microinjection :

    يرصد الإبرة من أنبوب الشعرية الخاصة التي تحتوي على خيوط الزجاج الداخلية ، وهذه الخيوط هي بمثابة الفتيل من أجل حل الحمض النووي. يتم سحب هذه على جهاز إبرة مجتذب. نستخدم PP - 830 Narishige مجتذب مع إعداد الحرارة 24.8. يتم سحب الإبر عدة في وقت واحد ويتم تخزينها في مربع صغير من البلاستيك. ويمكن بسهولة متعددة الإبر "منصة" على شريط من الطين النمذجة للتخزين الطويل الأجل.

  5. إبرة غيض "الخارجين" :

    يتم سحبها رأس الإبرة microinjection الغرامة بحيث يتم مغلقة فعليا عند نهاية وأنه ينبغي كسر المفتوحة باستخدام شظايا صغيرة من الزجاج غطاء. وتعد هذه الاشارات من 18 X 18 مم غطاء زجاجي في منشفة ورقية وتطبيق الضغط برفق حتى تقطع إلى عدة قطع. شظايا من حجم مفيدة ما يقرب من 3 × 4 مم.

  6. تنمو البرية نوع (N2) الديدان إلى مرحلة الكبار في وقت مبكر عن طريق الحقن باستخدام الاجراءات القياسية 6. تعد نحو 100 نظموا صحيح الديدان / بناء حقن.

إجراء

  1. فتح صمام الرئيسي على دبابة الهيليوم التي متصلة microinjection ذراع وحامل إبرة. إغلاق صمام منظم للسماح للغاز للدخول على الخط ، ليصل الضغط إلى 35 رطل في البوصة المربعة. إشعار التي يمكن أن يتم الافراج عن الغاز باستخدام دواسة القدم.

  2. اضافة الى وجود رافعة إبرة في الفم أنابيب pipetter القياسية (وجدت في حاوية من أنابيب الزجاج الشعرية) ووضع كمية صغيرة من الخليط البلازميد (~ 1 ميكرولتر).

  3. وضعت بعناية لودر إبرة في نهاية الجزء الخلفي من إبرة الحقن ، وإدراج بلطف على طول الطريق من خلال طولويرى الإبرة حتى المقاومة. طرد حل الحمض النووي التي تهب بلطف ، ثم إزالة المحمل.

  4. ادخال الإبرة في ذراعه microinjection ، والحرص على وضعه داخل طوقا المطاط الداخلية الصغيرة.

  5. وضع كسرة إبرة كسر الزجاج غطاء على أحد حافة منصة آغار. تغطي قشرة ، وكذلك على سطح لوحة كاملة من آغار ، مع الهالوكربون النفط. مكان لوحة أغار على مرحلة مجهر مقلوب.

  6. وضع الإبرة في وسط الميدان عرض باستخدام الهدف 4X وساطعة الإضاءة الميدان ، ولكن لا أقل إلا أنها في النفط. أيضا ، موقف الحافة الداخلية للقشرة من الزجاج تغطي في الوسط ، ثم التركيز على أنه (لا تزال تستخدم الهدف 4X). انخفاض الإبرة في النفط ، مما جعلها الطائرة التنسيق نفس كسرة من الزجاج غطاء. رفع التكبير عن طريق التحول إلى هدف 40X. إعادة التركيز على حافة قشرة وإعادة رأس الإبرة ، إذا لزم الأمر.

  7. لفتح رأس الإبرة الحقن ، ودفع الإبرة برفق على حافة الغطاء كسرة الزجاج ، بينما في الوقت نفسه تطبيق نبضة قصيرة من الغاز عن طريق دواسة القدم. وسيتم الإبرة مكسورة بما فيه الكفاية عندما فتح قطرات صغيرة من السائل الهروب نهاية الإبرة. تدفق السوائل الزائدة بسبب فتح كبيرة جدا غير مرغوب فيه ، لأنها سوف تقتل الحيوانات.

  8. إزالة لوحة آغار من مرحلة عن طريق رفع الإبرة ، ولكن لا تغير في موقف أو X - Y - المحور. الشريحة المرحلة من تحت الإبرة ، وإزالة لوحة آغار ووضعه على مجهر تشريح. نقل دودة كي تستقر على الوسادة ، تحت سطح الزيت. إذا التواءات دودة ، والسكتة الدماغية برفق حتى اتصالات لوحة آغار. وينبغي أن الدودة رطبة التمسك agarose الجافة.

  9. حقن
    1. المكان بسرعة خلف منصة أغار على خشبة المسرح ، وتركزت الدودة في مجال الرؤية.
    2. انخفاض الإبرة في نفس الطائرة من التركيز على الدودة.
    3. تبديل المرشحات لالإضاءة هوفمان (نوع من تصفية التباين). وهذا يسمح بالتفصيل المورفولوجية من الدودة لتصبح مرئية. إذا Nomarski / مدينة دبي للإنترنت بصريات متاحة على نطاق مقلوب التي ستعمل كذلك. الهدف باستخدام 40X ، والتركيز على مركز "محببة" المخلوي في الغدد التناسلية دودة ، تحت نمط "العسل" من نوى الجرثومية (اختر أيهما التناسلية يتوضع على الجانب من الدودة التي تواجه الإبرة).
    4. صقل موقف الإبرة حتى التلميح أيضا في التركيز (الطائرة ذاتها في "التحبب" الغدد التناسلية).
    5. إدراج بلطف الإبرة في وسط الغدد التناسلية وتطبيق نبضة قصيرة من ضغط الغاز لطرد قطرة أو اثنتين من الحمض النووي في الذراع الغدد التناسلية. يجب أن نلاحظ انتشار موجة من السائل عبر الغدد التناسلية القاصي. لا تتحمل المزيد من السائل هو أفضل ، لأن الكثير من السوائل يمكن أن تتدفق إلى ثني ذراع القريبة من الغدد التناسلية ، والتي يمكن إيقاف إنتاج البويضة. إذا كان ذلك ممكنا ، تبعا للموقف من الدودة ، وضخ الذراع التناسلية الأخرى بنفس الطريقة.
    6. من المهم العمل بسرعة في حين حقن الدودة ، لأنها يمكن أن يجفف بسهولة. قرار لحقن ذراع التناسلية الثاني يعتمد على مدى السرعة التي يمكن إعادة وضع الإبرة ودودة. ينبغي أن تأخذ العملية برمتها بشكل مثالي أقل من 1-2 دقائق.

  10. إزالة الزجاج غطاء من مرحلة وضعها على نطاق تشريح. تطبيق 1μl العازلة من M9 (22mm و KH 2 PO 4 ، 42mM نا 2 هبو 4 ، 85mm و كلوريد الصوديوم ، 1MM MgSO 4) مباشرة على دودة حقن (وهذا قد يستتبع غمر غيض ماصة تحت السطح من النفط الهالوكربون). يجب ترطيب المنطقة العازلة الدودة ، وسوف تطفو على السطح ثم قبالة منصة agarose. نقل الدودة إلى لوحة العادية باستخدام التقاط الدودة. ويمكن إعادة استخدام لوحة agarose عدة مرات أكثر حتى أنها أصبحت مشبعة جدا مع عازلة والديدان لم تعد تلتزم.

اختيار المعدلة وراثيا

  1. يتم نقل حقن الديدان ، و0 ف جيل ، لوحات فردية ، طازجة المصنف البكتريا (60 ملم) والسماح لها بالتكاثر. عادة ، يتم حقن الحيوانات المحتضنة في 20 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام حتى تظهر ذرية.

  2. ويلاحظ أن F 1 ذرية للحصول على أدلة من علامة المعدلة وراثيا (مثل مضان) باستخدام stereomicroscope الفلورسنت. كل الفلورسنت ، الناقل F 1 ، يتم استنساخ الحيوانات بشكل منفصل على لوحة جديدة (منذ تعتبر النسل من كل F 1 خطا متميزا). يسمح للF 1 المخنثين على الإنجاب. مرة أخرى ، وعادة ما يتم تنفيذ ذلك في عند 20 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام حتى تظهر ذرية.

  3. ويلاحظ في 2 F توليد للحيوانات معدلة وراثيا كذلك. تعتبر F 2 الحيوانات التي ورثت وأعرب عن مجموعة معدلة وراثيا "مستقرة" الخط.

    ملاحظة : في الحادي و1 واوالعمر قد يكون هناك العديد من الحيوانات المحورة وراثيا ، لكنها ليست مستقرة. فإن الغالبية العظمى من الحيوانات المعدلة وراثيا F 1 لا يمكن نشرها في F 2 خطوط مستقرة.

    ملاحظة : للسيطرة على التغير في الجين في عدد النسخ ، وتوليد ما لا يقل عن ثلاثة خطوط مستقرة ومستقلة في بناء حقن.

  4. ينبغي الحفاظ على كل سطر مستقل ومستقر كخط منفصلة من الديدان. ويمكن نشر كل سطر من خلال نقل الحيوانات المعدلة وراثيا عدة لوحة جديدة في كل جيل ، ويجب أن يتم تنفيذ هذا باستخدام stereomicroscope الفلورسنت إذا هو علامة اختيار الفلورسنت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عند القيام بهذا الإجراء ، فإنه من المهم أن نتذكر أن :
-- حقن مباشرة في مركز الغدد التناسلية
-- لا حقن السائل الكثير
-- العمل بسرعة لمنع أصاب.

إذا واجهت مشاكل مع الإبرة ، مثل كسره كبيرة جدا ، فمن الأفضل لإعادة إبرة جديدة ، بدلا من محاولة لحقن مع أقل من الإبرة المثالي.

جيل من الديدان المعدلة وراثيا العديد من التطبيقات مثل :
-- تحديد الجينات الطافرة في طريقة تسمى التحول الانقاذ
-- رسم خرائط المجالات البروتين من خلال التعبير عن البروتينات اقتطاع
-- توصيف دور الجينات في العمليات الخلوية والمرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

نود أن نعترف الروح التعاونية لجميع أفراد مختبر كالدويل. وقد تم دعم حركة البحث اضطرابات في المختبر من خلل التوتر باخمان شتراوس ومؤسسة باركنسون ، مؤسسة باركنسون المتحدة الأمريكية جمعية مرض باركنسون ، جمعية مرض باركنسون ولاية ألاباما ، وجيه مايكل فوكس مؤسسة للأبحاث مرض باركنسون ، والبحوث الجامعية.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef Hulle 10S elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm Fisher Scientific 12-548-A
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Coverglass 22x50 mm Fisher Scientific 12-545-E
100 ul Capillary VWR international 53432-921
Glass Capillary for Needles "Kwik-Fil" World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Needle Puller Tool Narishige International Model PP-830
microINJECTOR System Tritech Research, Inc. MINJ-1000 Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  2. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  3. Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
  4. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Comments

11 Comments

  1. Dear Dr. Laura A,   I am very much interested to work with you as a Researcher. Regarding myself, I would like to inform you that I did my Ph.D. degree from the Faculty of Science, Hiroshima University, Japan. I completed my M.Phil. M.Sc. and B.Sc. (Honours) degree from the University of Rajshahi, Bangladesh. Now I am working on toxic response and behavior of C. elegans as a postdoctoral researcher at Pusan National University, S. Korea.    I would be glad if you would kindly accept me as a Researcher in your Laboratory and provide me a fellowship or any financial support.   I look forward to your kind reply at your earliest convenience.   With best regards   Sincerely yours, Dr. M. Golam Mortuza Present Address Postdoctoral Researcher Lab of Ecology and Behavior System Division of Biological Sciences Pusan National University Busan 609-735, S. Korea E-mail: mortuzaru@yahoo.com   Permanent Address Professor Department of Zoology Rajshahi University Rajshahi 6²05, BANGLADESH E-mail: mortuza@ru.ac.bd

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 2:41 AM
  2. Hi, i am learning microinjection in C. elegans and am having problems recovering the worms.  They seem to recover fine initially and are thrashing around in the buffer on the plate, but after a day when I look back they have all died on the plate where they were placed.  I don't know what is wrong, do you have any suggestions? Thanks. Jane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 22, 2009 - 1:57 PM
  3. Dear Jane,
    Death post injection is likely from two causes. The first is that the worms spent too much time stuck down on the agar pad before being hydrated off. Often they will be alive (barely) but then die. Reducing the time they spend stuck down will stop this source of death. As you become more adept and quicker with the process this will improve. The second cause of post injection death is from the worm getting stabbed too much- either from being injected in the wrong place (intestine), being injected too deeply (the &#x²01C;shish-kabob&#x²01D; mistake) or using too big of a needle. Often one can tell if this is the problem when the next day the injected worm has exploded out its guts. Make sure you are using a very tiny, fine tip in the needle and only barely enter under the cuticle into the gonad. Again these will improve with practice.

    One last thought- when you transfer the worm from the injection pad to the plate sometimes oil comes along with it. Gently move the worm out from the oil droplet onto the food. This will help it recover.
    Good luck!

    Laura

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 1:18 PM
  4. Hi Laura,
    Thanks so much for replying to my message. I think my problem is that I am always injecting in the wrong place. Occasionally they explode after injection, in which case I know I have injected too much or stabbed too much. My needle is very fine and is penetrating quite easily but only every once in a while dŒs it look like I have hit the gonad. I am trying to line it up so that I can see the nuclei on either side, but I still seem to miss most of the time. It mostly seems to be in the body of the worm. Do you have any tips for how I can improve my accuracy of hitting the gonad?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 3:20 PM
  5. Dear Jane,
    I was trying to figure out how to help you visualize exactly where to inject. Here are some additional pointers and details from the video.

    I discuss how the dead center best spot for injecting is in the grainy interior of the gonad. Depending on your optics this may be very faint and hard to see. This graininess is like sand compared to the &#x²01C;pebble&#x²01D;-like appearance of the intestine. The gonad interior has also been described as a fine &#x²01C;velvetly&#x²01D; texture.

    If you go back and watch the video at time 8:08 that worm is a little too dry- see how the embryos (which don&#x²019;t dry out) are standing out more.
    In frame 8:²7 a nice view of the gonad with the arrow is shown. You can see an impression of the germ nuclei, but the &#x²01C;graininess&#x²01D; isn&#x²019;t too visible.
    Starting at 8:4² there is also a nice view of the animal and its major features. The lower left portion curving up towards the left is intestine. On the upper side moving towards the right are oocytes from the distal arm of the gonad. In the middle, between the oocytes and the intestine, lies a view of the proximal gonad exactly where it should be injected. At 8:53 the needle seems to be positioned correctly but what you see upon injection is the oocytes expanding outward, indicating that the needle tip wasn&#x²019;t positioned properly.
    At 9:06 shows a perfect gonad hit.

    Also, I try (if possible) to position the worm such that I am injecting closer to parallel to the worm rather than perpendicular to it. The force needed to puncture the cuticle when coming in at a 90o angle to the long axis of the worm is higher and results in a greater chance of going through into the intestine or even &#x²01C;shish-kabob&#x²01D;. I usuall try to position the worm and the needle at 15-30o angles to each other. For example see 8:53 & 9:06 (preferred) vs 8:57

    Hope these will help you.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    June 15, 2009 - 11:47 AM
  6. Hello!

    I am currently designing an automated system for c.elegans injections that involves circulating worms through microchannel in a PDMS chip and positioning them for injection from a microneedle. One of the important aspects of our design is to fabricate microneedles which can more easily puncture the worm's cuticle due to smaller needle size.

    However, we have been unable to find any reference, print or electronic, that has measured the force needed to puncture the worm. This force is important in choosing how thin our needles can be, and of course the force dŒs vary with needle tip size. We may need to experimentally determine this "puncture strength" ourselves as the first to ever do so, but I am wondering if you might know of anyone who has measured similar parameters that we can at least get a ballpark place to start.

    Thanks so much!

    -- Andrew

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 5:52 PM
  7. Andrew,

    We are not aware of the type of precise information on puncture strength or penetration forces required for C. elegans, as we are molecular biologists, but your question reminded me of a method I remembered (and once tried without success) from the late 1990s. The technology you describe is likely much improved or can be. Check out this paper and maybe contact the authors regarding your question.

    Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.
    Hashmi S, Ling P, Hashmi G, Reed M, Gaugler R, Trimmer W.
    Biotechniques. 1995 Nov;19(5):766-70.

    Best of luck with your experiments. If you are ever interested in us to beta-test something as collaborators, please let us know.

    Guy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 8:38 PM
  8. Hello,

    I am currently trying to inject double stranded DNA as an alternative approach to do tissue specific knockdown. I am following a protocol in which DNA sense and antisense fused to tissue specific promoter are injected together with a marker. According to the protocol, I should inject the PCR product directly and at the concentration of 100 ng/ul. However, when I injected this mixture into the gonad, most of the worms don't survive more than one day, which is not the case with the normal injection for generating the transgenic line.

    DŒs someone have any experience with this and can suggest me something that I should change or incorporate in my protocol to make the injection work?

    Thanks before,
    Yemima

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 6, 2011 - 12:21 PM
  9. We would like to start doing microinjections in our lab and I am would like to know where you acquired the halocarbon oil. In the Wormbook microinjection protocol, Series 700 Halocarbon oil from Halocarbon Products in NJ was used. Do you know how this compares to the Voltalef halocarbon oil that you used?

    Thank you very much for your help and for the wonderful instructional video!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 13, 2013 - 1:40 PM
  10. Dear Erin,
    We no longer can get the Voltalef oil and have too switched to using Halocarbon oil 700 (but ours is from Sigma). It is a bit thinner than the Voltalef, but it works as well, if not even a little better. Glad you like the video. Good luck with the injections. --Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    March 13, 2013 - 2:59 PM
  11. Thank you so much!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 17, 2013 - 11:51 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats