マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Published 8/15/2008
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Biology

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Summary

このビデオでは、トランスジェニック動物を作成するために線虫の生殖巣にマイクロインジェクションのテクニックを示しています。

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Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).

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Abstract

トランスジェニック線虫(Caenorhabditis elegans)は、容易に生殖腺1内へのDNAプラスミド溶液のマイクロインジェクションを使用して作成することができます。プラスミドDNAは安定して実際の染色体の2と同じ効率でも、ではない継承されている体外コンカテマーを形成するために再配置。目的の遺伝子は、解剖顕微鏡下でトランスジェニック動物の選択を可能にするために、そのようなROL - 6やGFPなどの明らかな表現型マーカーと共注入されます。外来遺伝子は、細胞内局在の研究のためにその天然のプロモーターから発現させることができる。また、導入遺伝子は、その特定の細胞または組織における遺伝子産物の役割を評価するために、異なる組織特異的プロモーターによって駆動することができます。この手法は、効率的に生殖細胞または初期胚3以外C. elegansの全組織での遺伝子発現を駆動します。トランスジェニック動物の作成は、広く実験的なパラダイムの範囲に利用されている。このビデオでは、トランスジェニックワームを生成するためにマイクロインジェクションの手順を示しています。さらに、安定したトランスジェニック線虫の行の選択と維持管理が記載されている。

Protocol

発現プラスミドの構築

二つのプラスミドが必要です。興味と選択可能な形質転換マーカーとしての第二の遺伝子の組織特異的発現のための1つを。

実験的なプラスミド

  1. 例えば、関心の組織/細胞型で発現するプロモーター、、神経または筋肉特異的プロモーターを選択してください。一同一組織内の複数の遺伝子を発現する場合、ゲートウェイシステム(インビトロジェン社)でプラスミドのプロモーターカセットを使用することができます。このアプローチは、組換えクローニングの4によるプロモーターの関心の下流に任意の遺伝子の挿入が可能になります一般に、上流配列の2-5 KBが正しいと正確な表現を持つのに十分である。

  2. 目的の遺伝子のcDNAは、2つの方法でクローニングすることができる。
    1. 制限酵素を用いて従来のクローニング。
    2. ゲートウェイのクローニングの場合、それは、PCRは、ゲートウェイATT B組換え配列を含むプライマーを用いて増幅される。増幅したcDNAは、最初のエントリのベクトルを作成するにはドナーベクターのpDONR201に再結合して、E.に変換されます大腸菌株DH5a。成功した組換え体とDNAのミニプレップ分離の選択後、エントリーベクターは、プロモーターを含む発現プラスミドを作成するデスティネーションベクターに再結合されています。組み換えクローン作成の詳細については、InvitrogenのGatewayのマニュアルから、またはコールドウェルらで用意されています。5。

プラスミド選択可能なマーカー

トランスジェニックマーカープラスミドの例としては、ROL - 6または蛍光タンパク質の発現を駆動するために体壁筋のプロモーターUNC - 54の使用を含む。これらのマーカープラスミドは、要求に応じて研究コミュニティ内から通常ご利用いただけます。

C. elegansのマイクロインジェクション

準備

  1. 注入される2つのプラスミドのDNAの分離を実行します。それらを定量し、50 ng /μlにそれぞれの1:1の比率で混ぜる。

  2. 寒天パッドを準備します。
    1. 溶けるまで熱やマイクロ波、2%アガロース水溶液を加えます。
    2. ベンチトップ上で複数の22 × 50mmのカバーガラスを設定します。
    3. パスツールピペットを使用して、1のカバーガラス上に溶融アガロースのドロップを配置し、すぐに最初に90の角度で降下上に第2カバーガラスを配置。他のいくつかのカバーガラスについて、この手順を繰り返します。アガロースの平坦化されたディスクの直径は15〜20 mmの間でなければなりません。
    4. アガロースが(これは時間がかかりますのみ)固化した後、カバーガラスを削除し(一晩に数時間)パッドが完全に空気乾燥することができます。
    5. 室温でカバーガラスのボックスにパッドを保管してください。

  3. DNA溶液のための針のローダーを作成します。

    針ローダーは、直火上の真ん中で加熱し、急速に約2倍の長さに引っ張られて、100μlのキャピラリーチューブから作成されます。キャピラリーチューブの温度が下がると、次の2つの半分は離れてスナップされる。注射10〜20針ローダーを備蓄する。マイクロチューブのラックに垂直に保管してください。使用するには、ポイントに身を突き刺すようにすることを注意してください

  4. マイクロインジェクションの針を作る:

    針は、内部のガラスフィラメントを含む特殊なキャピラリーチューブから作られ、このフィラメントは、DNA溶液のための芯となっています。これらは、針 - プラーのマシン上でプルアップされています。我々は24.8の熱設定でナリシゲPP - 830プーラーを使用してください。いくつかの針が一度に引き下げられ、小さなプラスチックの箱に格納されています。複数の針は容易に長期保存のための粘土のストリップの"マウント"することができます。

  5. 針の先端"ブレーカー":

    マイクロインジェクションの針の先端は、それが実際にそれで終わりに閉じられるよううまく引き出されており、カバーガラスの小さな破片を使用して開いて分割する必要があります。これらは、ペーパータオルで18 × 18 mmのカバーガラスをラッピングして、いくつかの部分に分解するまでゆっくりと圧力を加えることによって調製される。便利なサイズの断片は、約3 × 4 mmである。

  6. 標準的な手順6を使用して注入するための早期成人の段階に野生型(N2)ワームが成長する。約100の準備が適切にワームを上演/注入構築。

手順

  1. マイクロインジェクションニードルアームとホルダーに接続されているヘリウムタンク上のメインバルブを開きます。ガスは35 psiに圧力をもたらし、ラインを入力できるようにするレギュレータバルブを閉じます。ガスは、フットペダルを使用して解放することができることに注意してください。

  2. 標準的な口のピペッターチューブ(ガラスキャピラリーチューブの容器に見られる)に針のローダを挿入し、プラスミド混合物(〜1μl)を少量のを描く。

  3. 針のローダーは、の長さを介してすべての道を慎重に注射針のバックエンドに配置し、静かに挿入されます抵抗までの針が感じられる。軽く吹いてDNA溶液を追放し、ローダーを削除してください。

  4. 小さな内部のゴム製のガスケット内に配置するように注意して、マイクロインジェクションの腕に針を挿入します。

  5. 寒天のパッドの1つのエッジでカバーガラスの針破りのシャードを置きます。ハロカーボンのオイルで、シャードだけでなく、寒天のパッドの表面全体をカバーしています。倒立顕微鏡のステージ上の寒天のパッドを配置。

  6. 4X目的と明視野照明を使用して表示するフィールドの中央に針を置き、まだ石油に下ろしていない。また、中央のカバーガラスの破片の内縁の位置、それに焦点を当てて(まだ4X対物レンズを用いて)。カバーガラスの破片と同じ焦点面に取り込む、油に針を下ろします。 40X客観的に切り替えることで倍率を上げる。シャードの端に再び集中し、必要に応じて、針の先端の位置を変えます。

  7. フットペダルを介してガスの短いパルスを印加すると同時に、注射針の先端を開放し、穏やかに、カバーガラス破片の端に針を微調整する。液体の小さな液滴が針の端をエスケープするときに針が十分に開いて壊れてしまいます。それは動物を殺すので、あまり大きな開口部に起因する過剰な液体の​​流れは、望ましいことではありません。

  8. 針を上げることによって段階から寒天のパッドを取り出し、しかしX -またはY軸の位置を変更しないでください。針の下からステージをスライドさせ、寒天のパッドを削除し、解剖顕微鏡の上に置きます。油の表面の下に、パッド上にワームを転送します。ワームの蠢く、やさしくストロークの場合、それが接触寒天パッドをするまで。湿ったワームは、乾燥したアガロースに従う必要があります。

  9. 注射
    1. 素早く視野にワームを中心に、バックステージ上に寒天のパッドを配置。
    2. ワームのような焦点の同じ面に針を下ろします。
    3. ホフマン照明(コントラストのフィルタの種類)にフィルタを切り替えます。これは、ワームの形態学的詳細が見えるようになることができます。ノマルスキー/ DIC光学系も同様に動作する倒立スコープで利用可能な場合。 40Xの目的を使用して、胚の核の"ハニカム"パターン下のワームの生殖腺の"粗い"RSウイルスセンター、(針が直面しているワームの側に配置されている方性腺選択)に焦点を当てる。
    4. 微調整のヒントがフォーカスにもなるまで、針の位置(生殖腺"粒状感"と同じ平面)。
    5. ゆっくりと生殖腺の中央に針を挿入し、生殖腺の腕へのDNAの液滴または2つを追放するためにガス圧の短いパルスを適用する。あなたは、遠位生殖腺での液体拡散の波を観察する必要があります。あまりにも多くの液体は、卵母細胞の生産を停止することができます性腺腕の近位曲がり、に流れることができるので、より多くの液体は、優れていると仮定しないでください。可能であれば、ワームの位置に応じて、同じ方法で他の生殖腺の腕を注入する。
    6. それは容易に乾燥させることができるとして、それは、ワームを注入しながら迅速に作業することが重要です。第二生殖腺のアームを注入するという決定は、針とワームを再配置できる方法を迅速に依存している。全体のプロセスは、理想的に1〜2分未満を取る必要があります。

  10. ステージからカバーガラスを外し、解剖範囲の上に置きます。直接注入されたワームの上にM9バッファー(22mmのKH 2 PO 4、42mMのNa 2 HPO 4、85ミリメートルのNaCl、1mMのMgSO 4)し(これは、ハロカーボンオイルの表面下にピペットの先端を沈める伴うかもしれない)1μlの適用されます。バッファは、ワームを水分補給をする必要があります。これは、アガロースパッドの表面をオフにフロートします。ワームのピックを使用して、通常のプレートにワームを転送します。それはバッファと、もはや付着ワームにあまりにも飽和状態になるまでアガロースパッドはいくつかのより多くの回を再利用することができます。

トランスジェニック選択

  1. 注入されたワーム、P 0の世代は、個々の新鮮な、細菌接種したプレート(60 mm)に移して再現するために許可されています。子孫が表示されるまで、一般的に、注入された動物は、2〜3日間20℃でインキュベートする。

  2. F 1個体は、蛍光実体顕微鏡を用いてトランスジェニックマーカー(など蛍光など)の証拠が観察されています。各蛍光灯、キャリアF 1、動物は個別に(それぞれF 1から子孫ので明確な線とみなされる)新しいプレート上に複製されます。 F 1雌雄同体を再現するために許可されています。子孫が表示されるまで、再び、これは一般に20℃2〜3日間で行われます。

  3. F 2世代は、同様にトランスジェニック動物で観察される。継承とトランスジェニック配列を表現しているF 2動物は"安定的"行とみなされます。

    注:F 第1回年齢は、多くのトランスジェニック動物があるかもしれませんが、彼らは安定していないです。 F 1トランスジェニック動物の大半は、F 2、安定した回線に伝播されません。

    注:遺伝子のコピー数の変動を制御するために、注入された構築ごとに3つの独立した安定した線の最小値を生成する。

  4. それぞれ独立した安定したラインは、ワームの個別の行として維持されるべきである。各行は、各世代で新しいプレートにいくつかのトランスジェニック動物を移すことによって伝播することができます。選択可能なマーカーが蛍光灯の場合、これは蛍光実体顕微鏡を使用して実行する必要があります。

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Discussion

この手順を行うとき、それは覚えておくことが重要です。
- 生殖腺の中央に直接注入する
- あまりにも多くの液体を注入しない
- dessicationを防ぐために迅速に働く。

もしそれが大きすぎて壊れているような針、で問題に直面している場合、それはむしろ理想的な針よりも小さいと注入しようとするよりも、新鮮な針を再作成するのが最善です。

トランスジェニックワームの発生は、次のような多くのアプリケーションを持っています。
- 法と呼ばれる変換の救助の変異遺伝子の同定、
- 切り捨てタンパク質の発現を介してタンパク質ドメインのマッピング
- 携帯電話と病気の過程における遺伝子の役割の特性評価。

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Acknowledgements

我々はすべてコールドウェル研究室のメンバーの協力精神を認識したい。ラボにおける運動障害の研究は、バッハマン-シュトラウスジストニア&パーキンソン財団、米国パーキンソン財団、米国パーキンソン病協会、アラバマ州のパーキンソン病協会、パーキンソン病研究のためのマイケルJフォックス財団、および学部研究によってサポートされています。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef Hulle 10S elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm Fisher Scientific 12-548-A
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Coverglass 22x50 mm Fisher Scientific 12-545-E
100 ul Capillary VWR international 53432-921
Glass Capillary for Needles "Kwik-Fil" World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Needle Puller Tool Narishige International Model PP-830
microINJECTOR System Tritech Research, Inc. MINJ-1000 Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645

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References

  1. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  2. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  3. Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
  4. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Comments

11 Comments

  1. Dear Dr. Laura A,   I am very much interested to work with you as a Researcher. Regarding myself, I would like to inform you that I did my Ph.D. degree from the Faculty of Science, Hiroshima University, Japan. I completed my M.Phil. M.Sc. and B.Sc. (Honours) degree from the University of Rajshahi, Bangladesh. Now I am working on toxic response and behavior of C. elegans as a postdoctoral researcher at Pusan National University, S. Korea.    I would be glad if you would kindly accept me as a Researcher in your Laboratory and provide me a fellowship or any financial support.   I look forward to your kind reply at your earliest convenience.   With best regards   Sincerely yours, Dr. M. Golam Mortuza Present Address Postdoctoral Researcher Lab of Ecology and Behavior System Division of Biological Sciences Pusan National University Busan 609-735, S. Korea E-mail: mortuzaru@yahoo.com   Permanent Address Professor Department of Zoology Rajshahi University Rajshahi 6²05, BANGLADESH E-mail: mortuza@ru.ac.bd

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 2:41 AM
  2. Hi, i am learning microinjection in C. elegans and am having problems recovering the worms.  They seem to recover fine initially and are thrashing around in the buffer on the plate, but after a day when I look back they have all died on the plate where they were placed.  I don't know what is wrong, do you have any suggestions? Thanks. Jane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 22, 2009 - 1:57 PM
  3. Dear Jane,
    Death post injection is likely from two causes. The first is that the worms spent too much time stuck down on the agar pad before being hydrated off. Often they will be alive (barely) but then die. Reducing the time they spend stuck down will stop this source of death. As you become more adept and quicker with the process this will improve. The second cause of post injection death is from the worm getting stabbed too much- either from being injected in the wrong place (intestine), being injected too deeply (the &#x²01C;shish-kabob&#x²01D; mistake) or using too big of a needle. Often one can tell if this is the problem when the next day the injected worm has exploded out its guts. Make sure you are using a very tiny, fine tip in the needle and only barely enter under the cuticle into the gonad. Again these will improve with practice.

    One last thought- when you transfer the worm from the injection pad to the plate sometimes oil comes along with it. Gently move the worm out from the oil droplet onto the food. This will help it recover.
    Good luck!

    Laura

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 1:18 PM
  4. Hi Laura,
    Thanks so much for replying to my message. I think my problem is that I am always injecting in the wrong place. Occasionally they explode after injection, in which case I know I have injected too much or stabbed too much. My needle is very fine and is penetrating quite easily but only every once in a while dŒs it look like I have hit the gonad. I am trying to line it up so that I can see the nuclei on either side, but I still seem to miss most of the time. It mostly seems to be in the body of the worm. Do you have any tips for how I can improve my accuracy of hitting the gonad?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 3:20 PM
  5. Dear Jane,
    I was trying to figure out how to help you visualize exactly where to inject. Here are some additional pointers and details from the video.

    I discuss how the dead center best spot for injecting is in the grainy interior of the gonad. Depending on your optics this may be very faint and hard to see. This graininess is like sand compared to the &#x²01C;pebble&#x²01D;-like appearance of the intestine. The gonad interior has also been described as a fine &#x²01C;velvetly&#x²01D; texture.

    If you go back and watch the video at time 8:08 that worm is a little too dry- see how the embryos (which don&#x²019;t dry out) are standing out more.
    In frame 8:²7 a nice view of the gonad with the arrow is shown. You can see an impression of the germ nuclei, but the &#x²01C;graininess&#x²01D; isn&#x²019;t too visible.
    Starting at 8:4² there is also a nice view of the animal and its major features. The lower left portion curving up towards the left is intestine. On the upper side moving towards the right are oocytes from the distal arm of the gonad. In the middle, between the oocytes and the intestine, lies a view of the proximal gonad exactly where it should be injected. At 8:53 the needle seems to be positioned correctly but what you see upon injection is the oocytes expanding outward, indicating that the needle tip wasn&#x²019;t positioned properly.
    At 9:06 shows a perfect gonad hit.

    Also, I try (if possible) to position the worm such that I am injecting closer to parallel to the worm rather than perpendicular to it. The force needed to puncture the cuticle when coming in at a 90o angle to the long axis of the worm is higher and results in a greater chance of going through into the intestine or even &#x²01C;shish-kabob&#x²01D;. I usuall try to position the worm and the needle at 15-30o angles to each other. For example see 8:53 & 9:06 (preferred) vs 8:57

    Hope these will help you.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    June 15, 2009 - 11:47 AM
  6. Hello!

    I am currently designing an automated system for c.elegans injections that involves circulating worms through microchannel in a PDMS chip and positioning them for injection from a microneedle. One of the important aspects of our design is to fabricate microneedles which can more easily puncture the worm's cuticle due to smaller needle size.

    However, we have been unable to find any reference, print or electronic, that has measured the force needed to puncture the worm. This force is important in choosing how thin our needles can be, and of course the force dŒs vary with needle tip size. We may need to experimentally determine this "puncture strength" ourselves as the first to ever do so, but I am wondering if you might know of anyone who has measured similar parameters that we can at least get a ballpark place to start.

    Thanks so much!

    -- Andrew

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 5:52 PM
  7. Andrew,

    We are not aware of the type of precise information on puncture strength or penetration forces required for C. elegans, as we are molecular biologists, but your question reminded me of a method I remembered (and once tried without success) from the late 1990s. The technology you describe is likely much improved or can be. Check out this paper and maybe contact the authors regarding your question.

    Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.
    Hashmi S, Ling P, Hashmi G, Reed M, Gaugler R, Trimmer W.
    Biotechniques. 1995 Nov;19(5):766-70.

    Best of luck with your experiments. If you are ever interested in us to beta-test something as collaborators, please let us know.

    Guy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 8:38 PM
  8. Hello,

    I am currently trying to inject double stranded DNA as an alternative approach to do tissue specific knockdown. I am following a protocol in which DNA sense and antisense fused to tissue specific promoter are injected together with a marker. According to the protocol, I should inject the PCR product directly and at the concentration of 100 ng/ul. However, when I injected this mixture into the gonad, most of the worms don't survive more than one day, which is not the case with the normal injection for generating the transgenic line.

    DŒs someone have any experience with this and can suggest me something that I should change or incorporate in my protocol to make the injection work?

    Thanks before,
    Yemima

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 6, 2011 - 12:21 PM
  9. We would like to start doing microinjections in our lab and I am would like to know where you acquired the halocarbon oil. In the Wormbook microinjection protocol, Series 700 Halocarbon oil from Halocarbon Products in NJ was used. Do you know how this compares to the Voltalef halocarbon oil that you used?

    Thank you very much for your help and for the wonderful instructional video!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 13, 2013 - 1:40 PM
  10. Dear Erin,
    We no longer can get the Voltalef oil and have too switched to using Halocarbon oil 700 (but ours is from Sigma). It is a bit thinner than the Voltalef, but it works as well, if not even a little better. Glad you like the video. Good luck with the injections. --Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    March 13, 2013 - 2:59 PM
  11. Thank you so much!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 17, 2013 - 11:51 AM

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