Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Published 8/15/2008
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Biology

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Summary

이 동영상은 유전자 변형 동물을 만들 C. 엘레간스의 생식선에 microinjection의 기법을 보여줍니다.

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Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).

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Abstract

유전자 변형 Caenorhabditis의 엘레간스는 즉시 생식선 하나에 DNA 플라스미드 솔루션의 microinjection을 통해 만들 수 있습니다. 플라스미드 DNA는 염색체 안정 실제이 같은 효율성과 함께하지만,하지 상속됩니다 extrachromosomal concatamers을 형성 다시 배열. 관심 유전자는 해부 현미경으로 유전자 변형 동물의 선택을 허용하는 등 rol - 6 GFP와 같은 명백한 phenotypic 마커와 공동 주입이다. 외인성 유전자는 세포의 현지화 연구에 대한 기본 발기인의 표현 수 있습니다. 또는, transgene은 그 특정 세포 또는 조직에있는 유전자 산물의 역할을 평가하는 다른 조직에 특정한 모터에 의해 구동 수 있습니다. 이 기술은 효율적으로 germline 또는 초기 배아 3 제외한 C. 엘레간스의 모든 조직에서 유전자 발현을시킵니다. 유전자 변형 동물의 창조는 광범위하게 실험 패러다임의 다양한 활용합니다. 이 동영상은 유전자 변형 벌레를 생성하는 microinjection 절차를 보여줍니다. 또한, 안정적인 형질 C. 엘레간스 라인의 선정 및 유지 보수가 설명되어 있습니다.

Protocol

표현 플라스미드 건설

두 plasmids이 필요합니다 : 조직 특정 관심의 유전자의 표현과 선택 전환 표시로 두 번째 한.

실험 플라스미드

  1. 예를 들어 관심의 조직 / 세포 유형, 신경이나 근육 특정 발기인 표현하는 발기인을 선택합니다. 하나는 같은 조직 내에서 여러 개의 유전자를 표현하는 경우, 게이트웨이 시스템 (Invitrogen)에 플라스미드 발기인 카세트를 사용할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 recombinational 복제 4에 의해 모터의 관심 하류의 유전자의 삽입을 허용합니다. 일반적으로 상류 시퀀스의 2-5킬로바이트가 정확하고 정확한 표현을 가지고 충분하다.

  2. 관심 유전자의 cDNA는 두 가지 방법으로 복제하실 수 있습니다
    1. 제한 효소를 사용하여 기존 복제.
    2. 게이트웨이 복제의 경우, PCR은 게이트웨이 AT & T B recombinational 시퀀스를 포함하는 primers를 사용하여 증폭됩니다. 증폭된 cDNA 먼저 입력 벡터를 만들 수있는 기증자 벡터 pDONR201에 recombined 후 E.으로 변화됩니다 콜리 변형 DH5a. 성공 recombinants과 DNA의 미니 준비 고립의 선택에 따라, 입력 벡터는 표현식이 플라스미드 만들 수있는 프로 모터 함유 대상 벡터에 recombined입니다. recombinational 복제에 대한 자세한 내용은 Invitrogen 게이트웨이 설명서 중 또는 콜드웰 외에서 사용할 수 있습니다. 5.

플라스미드 선택 마커

형질 마커 plasmids의 예로는 rol - 6 또는 형광 단백질 발현을 유발하는 신체 벽 근육업자 UNC - 54의 사용을 포함합니다. 이러한 마커 plasmids 요청에 따라 연구 공동체 내에서 일반적으로 사용할 수 있습니다.

C. 엘레간스의 Microinjection

준비

  1. 주입 수있는 두 plasmids DNA의 격리를 수행합니다. 그들을 Quantitate 50 μl / NG 각 1:1 비율에 함께 섞는다.

  2. 한천 패드 준비 :
    1. 녹아 때까지 가열하거나 전자 레인지, 2 % 아가로 오스의 물 솔루션을 확인하십시오.
    2. benchtop 여러 22 X 50mm 커버 유리를 설정합니다.
    3. 파스퇴르 피펫을 사용 하나의 커버 유리에 녹인 아가로 오스의 드롭을 배치하고 바로 첫 번째 90 각도에서 드롭을 통해 두 번째 덮개 유리를 놓습니다. 여러 표지 안경에 대해 반복합니다. 아가로 오스의 평평 디스크의 직경은 15~20mm 사이 여야합니다.
    4. 아가로 오스가 (이 순간 밖에 걸리지 않습니다) 확정 후 덮개 유리를 제거하고 (야간에 몇 시간) 패드가 완전히 건조 공기 수 있습니다.
    5. 상온에서 커버 유리 상자에 패드를 저장합니다.

  3. DNA 솔루션에 대한 바늘 로더를 만들기 :

    니들 로더는 개방 불꽃을 통해 중간에서 온수 빠르게 두 번 정도 자신의 길이로 행진 100 μl 모세관 튜브에서 만들어집니다. 모세관이 냉각되면 두 개의 반쪽이 떨어져 먹습니다. 주사 바늘 10-20 로더를 비축. microcentrifuge 튜브 랙에 똑바로 보관하십시오. 사용 포인트에 자신을 찌르려고 않는 등주의하십시오.

  4. microinjection의 바늘 만들기 :

    바늘은 내부 유리 필라멘트를 포함하는 특수 모세관에서 만든,이 필라멘트는 DNA 솔루션 심지 역할을합니다. 이러한 바늘 풀러 컴퓨터에 뽑아 있습니다. 우리는 24.8의 열 설정 Narishige PP - 830 풀러를 사용합니다. 몇 바늘은 한 번에 뽑아 있으며 작은 플라스틱 상자에 저장됩니다. 여러 개의 바늘이 쉽게 장기 저장을위한 모델링 점토의 스트립에 "마운트"가 될 수 있습니다.

  5. 니들 팁 "차단기"

    microinjection 니들의 끝 그것은 실제로 그것을 결국 폐쇄되도록 잘 뽑아이며 커버 유리의 작은 파편을 사용하여 열고 깨진해야합니다. 이들은 종이 타월에 18 X 18mm 커버 유리를 포장하고 여러 조각으로 나누기까지 부드럽게 압력을 적용하여 준비가되어 있습니다. 유용한 크기의 파편은 약 3 X 4mm입니다.

  6. 표준 절차 6을 사용하여 사출을위한 초기 성인 무대에 야생 유형 (N2) 벌레를 성장. 약 100 준비가 제대로 벌레를 연출 / 주입 구축.

절차

  1. microinjection의 바늘 팔과 홀더에 연결된 헬륨 탱크의 주요 밸브를 엽니다. 가스 35 PSI로 압력을 가져, 라인을 입력 수 있도록 조절 밸브를 닫습니다. 가스가 발 페달을 사용하여 릴리스 될 수있다는 사실을 알아야한다.

  2. 표준 입 pipetter 튜빙 (유리 모세관 튜브의 용기에서 발견)로 바늘 로더를 삽입하고 플라스미드 혼합물 (~ 1 μl)의 소량을 그립니다.

  3. 바늘 로더는 신중하게 주사 바늘의 백 엔드에 위치하고 부드럽게의 길이 처음부터 끝까지 삽입저항까지 바늘이 느껴집니다. 부드럽게 불어하여 ​​DNA 솔루션을 추방 다음 로더를 제거합니다.

  4. 작은 내부 고무 가스켓 내에 배치주의하고, microinjection 암에 바늘을 삽입합니다.

  5. 한천 패드 중 하나를 가장자리에 커버 유리 바늘 파괴 조각을 놓으십시오. 할로 카본 오일, 조각뿐만 아니라 한천 패드의 전체 표면을 커버. 거꾸로 현미경의 무대에 한천 패드를 놓습니다.

  6. 4X 객관적이고 명시야 조명을 사용하여 볼 필드의 중앙에 바늘을 위치하지만, 아직 기름으로 낮은하지 않습니다. 또한, 중앙에 커버 유리 조각의 내부 가장자리에 위치 다음에 초점을 (여전히 4X 목표를 사용하여). 커버 유리 조각 같은 초점 비행기로 데려, 기름에 바늘을 낮춥니다. 40X 목표로 전환하여 배율을 올려. 조각의 가장자리에 집중할 필요한 경우, 바늘의 팁을 변경합니다.

  7. 발 페달을 통해 가스의 짧은 펄스를 적용하는 동시에 동안 주입 바늘 끝을 열려면, 부드럽게, 커버 유리 조각의 가장자리에 대한 바늘을 찔러. 액체의 작은 방울이 바늘의 끝을 벗어날 때 주사 바늘을 충분히 개방 고장 것입니다. 그것은 동물을 죽일 수 있으므로 너무 큰 개방으로 인한 초과 액체 흐름은 바람직하지 않습니다.

  8. 바늘을 높여 무대에서 한천 패드를 제거하지만, X 또는 Y 축 위치를 변경하지 마십시오. 바늘 아래에서 무대를 슬라이드, 한천 패드를 제거하고 해부 현미경에 그것을 놓으십시오. 기름의 표면 아래에 패드로 웜을 전송합니다. 웜 wriggles, 부드럽게 스트로크 경우는 연락처 한천 패드까지. 습한 웜은 건조 아가로 오스을 준수해야합니다.

  9. 주사
    1. 빠르게보기의 분야에서 벌레를 중심 무대로 한천 패드를 다시 넣으십시오.
    2. 웜으로 초점 동일한 비행기에 바늘을 낮춥니다.
    3. 호프만 조명 (콘트라스트 필터의 종류)에 필터를 전환합니다. 이것은 벌레의 형태학의 세부 사항이 표시 될 수 있습니다. Nomarski / DIC 광학은 잘 작동됩니다 거꾸로 범위에서 사용할 수있는 경우. 40X 목표를 사용하여 세균의 핵의 "벌집"패턴 아래 웜 생식선의 "낟알"syncytial 센터 (바늘을 직면하고있는 웜의 측면에 위치 중에서 생식선 선택)에 중점을두고 있습니다.
    4. 미세 조정 끝 (생식선 "graininess"같은 비행기) 초점 또한 때까지 바늘의 위치.
    5. 부드럽게 생식선의 중앙에 바늘을 삽입하고 생식선 팔로 DNA의 비말 또는 두 추방하는 가스 압력의 간단한 펄스를 적용합니다. 당신은 말초 생식선에 걸쳐 액체 확산의 물결을 준수해야합니다. 너무 많은 액체가 oocyte 생산​​을 종료할 수있는 생식선 팔 근위 구부로 흘러 수 있기 때문에 더 많은 액체가 더 좋은 가정하지 마십시오. 가능하다면, 웜의 위치에 따라 같은 방식으로 다른 생식선의 팔을 주입.
    6. 그것이 쉽게 건조시키다 수있는 그것은 벌레를 주입하면서 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 두 번째 생식선의 팔을 투입하기로 한 결정은 바늘과 벌레를 다시 배치할 수 있습니다 얼마나 빨리에 의존적일 수 밖에 없습니다. 전체 과정은 이상적으로 1~2분 미만 정도 소요됩니다.

  10. 무대에서 커버 유리를 제거하고 해부 범위에 놓으십시오. 직접 주입 벌레에 M9 버퍼의 1μl를 (22mM KH 2 PO 4, 42mM 나 2 HPO 4, 85mM NaCl, 1mM MgSO 4) (이것은 할로 카본 오일의 표면 아래에 피펫 팁을 잠수함이 잠수 수반 수도 있습니다)이 적용됩니다. 버퍼 벌레를 rehydrate해야한다 그것은 다음 아가로 오스 패드 표면을 부유합니다. 웜 선택을 사용하여 일반 접시로 웜을 전송합니다. 이 버퍼와 웜 더 이상 준수하지와도 포화 상태가 될 때까지 아가로 오스 패드는 몇 번 더 활용할 수 있습니다.

형질 선택

  1. 주입 웜, P 0 세대, 개별 신선한 bacterially 씨앗 접시 (60 ㎜)로 전송하고 재현 사용할 수 있습니다. 자식이 나타날 때까지 일반적으로 주입 동물은 2-3 일동안은 20 ° C에서 incubated입니다.

  2. F 1 아기는 형광 stereomicroscope를 사용하여 형질 마커 (예 : 형광 등)의 증거를 관찰하고 있습니다. 각 형광, 캐리어 F 1, 동물은 별도 (각 F 1부터 자손이 서로 다른 라인을 간주됩니다 이후) 새 접시에 복제됩니다. F 1 나온것은 재현할 수 있습니다. 자식이 나타날 때까지 다시, 이것은 일반적으로 20 ° C 2-3 일동안은에서 수행됩니다.

  3. F 2 세대뿐만 아니라 유전자 변형 동물에 대한 관찰이다. 상속 및 유전자 변형 배열을 표현하는가 F 2 동물은 "안정적인"라인 간주됩니다.

    참고 : F 1 일에나이가 많은 유전자 변형 동물이있을 수 있지만, 그들은 안정되지 않습니다. F 1 유전자 변형 동물의 대부분은 F 2 안정적인 라인에 전파되지 않습니다.

    참고 : 유전자 사본 번호 다양성에 대한 제어하려면, 주입 구조 지당 3 독립 안정적인 라인의 최소를 생성합니다.

  4. 각 독립적인 안정 라인 웜 별도의 라인으로 유지 관리해야합니다. 각 라인은 각 세대에서 새 접시에 여러 유전자 변형 동물을 전송하여 전파 될 수 있으며, 선택 마커가 형광면 이것은 형광 stereomicroscope를 사용하여 수행되어야합니다.

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Discussion

이 절차를 수행할 때, 그것은 기억하는 것이 중요합니다 :
- 생식선의 중심에 직접 주입
- 너무 많은 액체를 주입하지
- dessication을 방지하기 위해 신속하게 작동합니다.

당신이 너무 큰 고장 등 바늘과 문제에 실행하는 경우, 그것은 오히려 이상적인 바늘보다 적은 비용으로 주입하는 것보다, 신선한 바늘을 리메이크하는 것이 좋습니다.

유전자 변형 벌레의 생성과 같은 다양한 애플 리케이션을했습니다
- 돌연변이 유전자의 식별은 방법의 변형 구조라는
- 잘린 단백질의 표현을 통해 단백질 도메인 매핑
- 휴대폰과 질병 과정에서 유전자의 역할의 특성.

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Acknowledgements

우리 모두는 콜드 웰 연구소 회원의 협력 정신을 인정하고 싶습니다. 연구실에 운동 장애 연구는 바흐만 - 스트라우스 Dystonia & 파킨슨병 재단, 미국 파킨슨병 재단, 미국 파킨슨 질병 협회, 앨라배마 파킨슨병 협회, 파킨슨병 연구에 대한 마이클 J. 폭스 재단과 대학 연​​구소에 의해 지원되었습니다.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef Hulle 10S elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm Fisher Scientific 12-548-A
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Coverglass 22x50 mm Fisher Scientific 12-545-E
100 ul Capillary VWR international 53432-921
Glass Capillary for Needles "Kwik-Fil" World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Needle Puller Tool Narishige International Model PP-830
microINJECTOR System Tritech Research, Inc. MINJ-1000 Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645

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References

  1. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  2. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  3. Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
  4. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Comments

11 Comments

  1. Dear Dr. Laura A,   I am very much interested to work with you as a Researcher. Regarding myself, I would like to inform you that I did my Ph.D. degree from the Faculty of Science, Hiroshima University, Japan. I completed my M.Phil. M.Sc. and B.Sc. (Honours) degree from the University of Rajshahi, Bangladesh. Now I am working on toxic response and behavior of C. elegans as a postdoctoral researcher at Pusan National University, S. Korea.    I would be glad if you would kindly accept me as a Researcher in your Laboratory and provide me a fellowship or any financial support.   I look forward to your kind reply at your earliest convenience.   With best regards   Sincerely yours, Dr. M. Golam Mortuza Present Address Postdoctoral Researcher Lab of Ecology and Behavior System Division of Biological Sciences Pusan National University Busan 609-735, S. Korea E-mail: mortuzaru@yahoo.com   Permanent Address Professor Department of Zoology Rajshahi University Rajshahi 6²05, BANGLADESH E-mail: mortuza@ru.ac.bd

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 2:41 AM
  2. Hi, i am learning microinjection in C. elegans and am having problems recovering the worms.  They seem to recover fine initially and are thrashing around in the buffer on the plate, but after a day when I look back they have all died on the plate where they were placed.  I don't know what is wrong, do you have any suggestions? Thanks. Jane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 22, 2009 - 1:57 PM
  3. Dear Jane,
    Death post injection is likely from two causes. The first is that the worms spent too much time stuck down on the agar pad before being hydrated off. Often they will be alive (barely) but then die. Reducing the time they spend stuck down will stop this source of death. As you become more adept and quicker with the process this will improve. The second cause of post injection death is from the worm getting stabbed too much- either from being injected in the wrong place (intestine), being injected too deeply (the &#x²01C;shish-kabob&#x²01D; mistake) or using too big of a needle. Often one can tell if this is the problem when the next day the injected worm has exploded out its guts. Make sure you are using a very tiny, fine tip in the needle and only barely enter under the cuticle into the gonad. Again these will improve with practice.

    One last thought- when you transfer the worm from the injection pad to the plate sometimes oil comes along with it. Gently move the worm out from the oil droplet onto the food. This will help it recover.
    Good luck!

    Laura

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 1:18 PM
  4. Hi Laura,
    Thanks so much for replying to my message. I think my problem is that I am always injecting in the wrong place. Occasionally they explode after injection, in which case I know I have injected too much or stabbed too much. My needle is very fine and is penetrating quite easily but only every once in a while dŒs it look like I have hit the gonad. I am trying to line it up so that I can see the nuclei on either side, but I still seem to miss most of the time. It mostly seems to be in the body of the worm. Do you have any tips for how I can improve my accuracy of hitting the gonad?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 3:20 PM
  5. Dear Jane,
    I was trying to figure out how to help you visualize exactly where to inject. Here are some additional pointers and details from the video.

    I discuss how the dead center best spot for injecting is in the grainy interior of the gonad. Depending on your optics this may be very faint and hard to see. This graininess is like sand compared to the &#x²01C;pebble&#x²01D;-like appearance of the intestine. The gonad interior has also been described as a fine &#x²01C;velvetly&#x²01D; texture.

    If you go back and watch the video at time 8:08 that worm is a little too dry- see how the embryos (which don&#x²019;t dry out) are standing out more.
    In frame 8:²7 a nice view of the gonad with the arrow is shown. You can see an impression of the germ nuclei, but the &#x²01C;graininess&#x²01D; isn&#x²019;t too visible.
    Starting at 8:4² there is also a nice view of the animal and its major features. The lower left portion curving up towards the left is intestine. On the upper side moving towards the right are oocytes from the distal arm of the gonad. In the middle, between the oocytes and the intestine, lies a view of the proximal gonad exactly where it should be injected. At 8:53 the needle seems to be positioned correctly but what you see upon injection is the oocytes expanding outward, indicating that the needle tip wasn&#x²019;t positioned properly.
    At 9:06 shows a perfect gonad hit.

    Also, I try (if possible) to position the worm such that I am injecting closer to parallel to the worm rather than perpendicular to it. The force needed to puncture the cuticle when coming in at a 90o angle to the long axis of the worm is higher and results in a greater chance of going through into the intestine or even &#x²01C;shish-kabob&#x²01D;. I usuall try to position the worm and the needle at 15-30o angles to each other. For example see 8:53 & 9:06 (preferred) vs 8:57

    Hope these will help you.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    June 15, 2009 - 11:47 AM
  6. Hello!

    I am currently designing an automated system for c.elegans injections that involves circulating worms through microchannel in a PDMS chip and positioning them for injection from a microneedle. One of the important aspects of our design is to fabricate microneedles which can more easily puncture the worm's cuticle due to smaller needle size.

    However, we have been unable to find any reference, print or electronic, that has measured the force needed to puncture the worm. This force is important in choosing how thin our needles can be, and of course the force dŒs vary with needle tip size. We may need to experimentally determine this "puncture strength" ourselves as the first to ever do so, but I am wondering if you might know of anyone who has measured similar parameters that we can at least get a ballpark place to start.

    Thanks so much!

    -- Andrew

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 5:52 PM
  7. Andrew,

    We are not aware of the type of precise information on puncture strength or penetration forces required for C. elegans, as we are molecular biologists, but your question reminded me of a method I remembered (and once tried without success) from the late 1990s. The technology you describe is likely much improved or can be. Check out this paper and maybe contact the authors regarding your question.

    Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.
    Hashmi S, Ling P, Hashmi G, Reed M, Gaugler R, Trimmer W.
    Biotechniques. 1995 Nov;19(5):766-70.

    Best of luck with your experiments. If you are ever interested in us to beta-test something as collaborators, please let us know.

    Guy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 8:38 PM
  8. Hello,

    I am currently trying to inject double stranded DNA as an alternative approach to do tissue specific knockdown. I am following a protocol in which DNA sense and antisense fused to tissue specific promoter are injected together with a marker. According to the protocol, I should inject the PCR product directly and at the concentration of 100 ng/ul. However, when I injected this mixture into the gonad, most of the worms don't survive more than one day, which is not the case with the normal injection for generating the transgenic line.

    DŒs someone have any experience with this and can suggest me something that I should change or incorporate in my protocol to make the injection work?

    Thanks before,
    Yemima

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 6, 2011 - 12:21 PM
  9. We would like to start doing microinjections in our lab and I am would like to know where you acquired the halocarbon oil. In the Wormbook microinjection protocol, Series 700 Halocarbon oil from Halocarbon Products in NJ was used. Do you know how this compares to the Voltalef halocarbon oil that you used?

    Thank you very much for your help and for the wonderful instructional video!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 13, 2013 - 1:40 PM
  10. Dear Erin,
    We no longer can get the Voltalef oil and have too switched to using Halocarbon oil 700 (but ours is from Sigma). It is a bit thinner than the Voltalef, but it works as well, if not even a little better. Glad you like the video. Good luck with the injections. --Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    March 13, 2013 - 2:59 PM
  11. Thank you so much!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 17, 2013 - 11:51 AM

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