Aplicación de un ensayo de C. elegans la degeneración neuronal de dopamina para la validación del potencial de la enfermedad de Parkinson genes

Published 7/18/2008
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Biology

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Summary

Este video muestra cómo utilizar C. elegans para evaluar la neurodegeneración nerviosas dopaminérgicas como un modelo para la enfermedad de Parkinson. Además, las pantallas de genética se utilizan para definir los factores que mejoran la degeneración o neuroprotectoras.

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Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835, doi:10.3791/835 (2008).

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Abstract

Mejoras en el diagnóstico y el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (EP) dependen de los conocimientos sobre factores de vulnerabilidad que hacen que las poblaciones en riesgo. En el proceso de tratar de identificar nuevos factores genéticos asociados con la enfermedad, los científicos han generado muchas listas de genes candidatos, los polimorfismos y proteínas que representan importantes avances, pero estos conductores siguen mecánicamente indefinido. Nuestro trabajo está dirigido a reducir significativamente estas listas mediante la explotación de las ventajas de un sistema modelo animal simple. Mientras que los humanos tienen miles de millones de neuronas, la lombriz Caenorhabditis elegans microscópica tiene precisamente 302, de los cuales sólo ocho producir dopamina (DA) en hemaphrodites. Expresión de un gen humano que codifica la proteína asociada a la EP, la alfa-sinucleína, en C. elegans resultados neuronas DA de la dosis y la neurodegeneración dependiente de la edad.

Gusanos expresar humana alfa-sinucleína en las neuronas DA son isogénicas y expresar tanto las buenas prácticas agrarias y los derechos humanos alfa-sinucleína en el promotor del transportador de DA (Pdat-1). La presencia de GFP sirve como un marcador visualiza fácilmente para el seguimiento de la neurodegeneración DA en estos animales. Inicialmente se demostró que la alfa-sinucleína la neurodegeneración inducida por DA podrían ser rescatados en estos animales por torsinA, una proteína con actividad chaperona molecular 1. Además, el candidato PD relacionadas con los genes identificados en nuestro laboratorio a través de grandes esfuerzos de detección RNAi mediante una prueba de mal plegamiento de la alfa-sinucleína eran entonces sobre-expresado en C. elegans neuronas DA. Se determinó que cinco de los siete genes probados representado moduladores candidato importante de la EP, ya que rescató a la alfa-sinucleína inducida por la neurodegeneración DA 2. Además, el laboratorio de Lindquist (este número de Jove) ha llevado a cabo las pantallas de la levadura por el que la alfa-sinucleína toxicidad dependiente se utiliza como una lectura de los genes que pueden aumentar o suprimir la citotoxicidad. Nos examinó a continuación los genes candidatos de la levadura en nuestro ensayo de C. elegans neurodegeneración alfa-sinucleína y la inducida por validado con éxito muchos de estos tres objetivos, 4.

Nuestra metodología se basa en la generación de un vector de expresión de C. elegans DA neuronal específica con la clonación de cDNAs de recombinación de genes candidatos bajo el control del Pdat-1 promotor. Estos plásmidos son entonces microinyección de tipo salvaje (N2) gusanos, junto con un marcador de selección para la transformación exitosa. Múltiples líneas transgénicas estables de producir la proteína en las neuronas DA candidato se obtienen y se cruzó de manera independiente en la cepa de la alfa-sinucleína degenerativas y evaluados por la neurodegeneración, en el animal y el nivel de las neuronas individuales, en el curso del envejecimiento.

Protocol

A. Construcción de plásmido de expresión

Dos plásmidos son necesarios: una para la expresión específica de tejido del gen de interés y un segundo como marcador de transformación seleccionables (aunque el marcador plásmido está generalmente disponible dentro de la comunidad de investigación).

Experimental plásmido

  1. Seleccione un promotor que se expresa en el tipo de tejidos / células de interés, en este caso, el transportador de DA (Pdat-1) se utiliza el promotor. Este plásmido de expresión fue creada como una puerta de enlace Invitrogen sistema compatible con vector destino (pDEST-DAT-1) para permitir la inserción de un gen de interés aguas abajo del promotor de la clonación de recombinación 1.
  2. El cDNA del gen de interés es amplificado por PCR utilizando los cebadores que contienen la puerta de enlace att secuencia B de recombinación. El cDNA amplificado por primera vez se recombinan en el vector de donantes pDONR201 para crear el vector de entrada y luego se transformó en la cepa E. coli DH5a. Después de la selección de recombinantes éxito y mini-prep aislamiento de ADN, el vector de entrada es recombinada en el pDEST-DAT-1 vector de destino para crear el plásmido de expresión. Detalles sobre la clonación de recombinación están disponibles, ya sea el manual de Invitrogen Gateway o en Caldwell et al. 5.

Marcador seleccionable plásmido

Un marcador plásmido transgénico consiste en un vector con un promotor que determinan la expresión de una proteína fluorescente en un tejido obvio. En este procedimiento en particular, el promotor unc-54 unidades de expresión de la proteína de cerezo en el cuerpo de la pared muscular (punción-54:: cereza).

B. Generación de transgénicos a través de C. elegans microinyección

Ver artículo relacionado Jove: http://www.jove.com/index/details.stp?ID=833

C. cruza genética para el análisis de la neurodegeneración DA

  1. Los gusanos son cultivados usando procedimientos estándar de 6.
  2. Lugar 10 Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: GFP los hombres 1, 2 sobre una placa de acoplamiento con 4.3 L4 etapa hermafroditas transgénicos (que expresa Pdat-1:: gen X y punción de 54:: cherry) . Esto debe realizarse de forma individual para cada una de las tres líneas separadas estable creado. Después de dos días, eliminar a los machos.
  3. Inspeccione la generación F1, si hay varios hijos varones, el apareamiento tuvo éxito.
  4. Clon de 5 hermafrodita L4 animales de cada cruz que exhiben tanto el Pdat-1:: GFP fluorescentes marcador (heredado de los padres varones) y el 54 punción:: cherry pared fluorescentes cuerpo marcador de músculo (se hereda de los padres hermafrodita). Que los animales clonados tienen que estar en la etapa de L4 para asegurarse de que aún no han apareado con machos presentes en la placa. Les permitan auto-cross y producir una progenie F2.
  5. F2 animales producidos en el paso 3 se clonan a cabo. En concreto, la transferencia de los animales ~ 5.10 que exhiben ambos marcadores fluorescentes para sus platos individuales. Pantalla de la generación F3 para las placas donde el 100% de la GFP animales expresan en las neuronas DA y algunos de los animales se expresa la cereza en las células del cuerpo músculo de la pared. Estos animales serán homocigotos para el Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: gen GFP, mientras que de forma estable la transmisión de la recién creada transgén (gen X).

D. Análisis de las neuronas dopaminérgicas

  1. Prepare un plato fresco para cada una de las tres líneas creadas anteriormente, así como la Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: GFP sola cepa. Les permiten crecer a la edad adulta.
  2. La transferencia de los adultos 30-40 transgénicos de cada línea en un plato fresco. Les permitan sentar los embriones de 4 horas a 20 º C.
  3. Retire los adultos. Permita que los embriones para desarrollar durante 3-4 días a 20 º C hasta que alcancen la etapa de L4.
  4. Elige ~ 100 L4 transgénicos animales a una placa que contiene 0,04 mg / ml 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUDR). Este desarrollo nucleótidos bloques analógicos de la próxima generación a través de la inhibición de la síntesis de ADN, evitando así la descendencia de los animales de experimentación abrumadora 7. Proteger las placas FUDR de la luz, ya que es sensible a la luz.
  5. Los animales adultos se analizaron en varios días después de la puesta de huevos. El día de análisis apropiados se determinan empíricamente. Por ejemplo, hemos determinado que el 77%, 87% y 90% de los Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: GFP animales exhiben degenerado neuronas DA en los días 6, 7 y 10 de desarrollo posterior, respectivamente. Por lo tanto, si podemos predecir que el transgen de interés podría aumentar la neurodegeneración, vamos a analizar en el día 6 y / o 7. Del mismo modo, los transgenes que podrían suprimir la neurodegeneración se analizarán en los días 7 y 10.
  6. Hacer 4 pastillas de dulce de agarosa (a diferencia de las pastillas de microinyección agar, estos se utilizan frescos y no permitir que se seque). Se establecen dos portaobjetos de microscopio que tienen un pedazo de cinta a través de ellas, la cinta sirve como separador de pastillas de equivalente de espesor. Ponga un terciodeslice entre ellos en el banco (que se colocan de tres al día). Coloque una gota de agarosa fundida en el centro de la diapositiva y rápidamente poner otra diapositiva en la parte superior de la agarosa, perpendicular y en las tres diapositivas. Hacer varias almohadillas adicionales, dejando a los dos portaobjetos, hasta que la pastilla se encuentra listo para su uso.
  7. Para el análisis de gusano neuronas DA, el lugar una caída de 6 l de levamisol mm 3 (un anestésico) en un 22 x 30 mm cubierta de vidrio. Recoger 40 animales adultos (10 extra más allá de los 30 que anotó) dentro de la gota, y luego invertir la cubierta de cristal en la almohadilla de agarosa. Repita este procedimiento para cada una de las otras líneas.
  8. Puntuación 30 animales por cada línea de la presencia de cada CEP y la neurona ADE utilizando un microscopio compuesto con epifluorescencia y un cubo de filtro que permite la visualización del FITC o GFP. Nosotros usamos un filtro de ganar a las buenas prácticas agrarias HyQ cubo (Chroma Technology). Anota los datos en la hoja de registro adjunta. Animales de tipo salvaje mantendrá fluorescencia de GFP completa en todos los CEP 4 y 2 neuronas ADE. Animales individuales mostrando la pérdida de neuronas DA se califican como no-WT o "degeneración". Del mismo modo, el grado de degeneración se puede marcar, contando el total de las neuronas perdidas en cada animal, así como a la población.
  9. Repetir el análisis dos veces más (30 animales más por línea de prueba). El número total de gusanos de tipo salvaje exhibiendo las neuronas DA de las tres rondas de análisis es el promedio. El análisis estadístico para la neuroprotección continuación, se realiza utilizando la t de Student-test (p <0,05) para comparar los gusanos de control (Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: GFP) con las cepas que sobreexpresan genes en las neuronas DA .

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Discussion

La pérdida depende de la edad de las neuronas de dopamina es una característica clínica de la enfermedad de Parkinson y se ha asociado con la acumulación o el mal plegamiento de una proteína llamada alfa-sinucleína. Aquí se demuestra la forma de etiqueta, a través de un transgén fluorescentes, las neuronas dopaminérgicas de la C. elegans e imitar la neurodegeneración en la enfermedad de Parkinson por coexpressing humana alfa-sinucleína en estas células.

Este video muestra la metodología para el crecimiento, cruce genético, el montaje, y la puntuación de los nematodos transgénicos para evaluar los factores genéticos que, o bien mejorar la neurodegeneración o proporcionar neuroprotección en el curso del envejecimiento. Hay que tener cuidado de usar marcadores para el mantenimiento de los transgenes adecuadamente organizado masculinos y hermafroditas para asegurar el éxito de los cruces genéticos, y la coherencia en la puntuación de la pérdida de neuronas o de protección. De esta manera, C. elegans facilita una rápida evaluación de los factores genéticos y que puede contribuir a la neurodegeneración o representar dianas terapéuticas para mejorar la supervivencia de las neuronas.

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Acknowledgements

Queremos reconocer el espíritu de cooperación de todos los miembros Caldwell laboratorio. Movimiento de investigación trastornos en el laboratorio ha sido apoyado por la distonía Bachmann-Strauss y la Fundación Parkinson, Reino Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, Asociación de la Enfermedad de Parkinson de Alabama, la Fundación Michael J. Fox para la Investigación del Parkinson, y una investigación de Pregrado

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Microscope Slides Plain, 3x1" Fisher Scientific 12-549
Dissecting with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645
Epifluorescent Microscope Nikon Instruments Model E-800
Filter Cube, GFP HYQ Endow Bandpass Chroma Technology Corp.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  2. Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
  3. Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
  4. Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).

Comments

7 Comments

  1. Thank you for your research. My husband has Parkinson's. It's so good to know that young people are doing research which may ultimately help stem the onslaught of this disease, not in our lifetime, but perhaps in the near future. Where dŒs your study go from here? Good luck with your work. (reader from Vancouver, Canada)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 10, 2008 - 2:08 PM
  2. Hi I would like to know when you can view the GFP::Alpha Synuclein C. elegans? Also, dŒs the Alpha-synuclein slowly degenerate the neurons or dŒs it automatically degenerate them when the C. elegans are born? Do they have to be in the adult stage when viewed under the microscope?

    Reply
    Posted by: Hunter C.
    September 27, 2010 - 9:57 PM
  3. Oh wow, this is awesome.

    Reply
    Posted by: Dmitriy K.
    August 12, 2013 - 12:35 AM
  4. Hello! How does the GFP get viewed in the C. elegans? Is there a specific type of microscope needed or does the promoter of the gene need to be activated?

    Reply
    Posted by: Marilyn Z.
    January 25, 2014 - 1:25 AM
  5. Hi. 1) To view GFP you need a microscope equipped with special (UV) light and fluorescent filters to excite the GFP molecule and capture the emissions. 2) This is a biological question, not so much an equipment question. The power of GFP and similar fluorescent molecules is that as long as they are expressed in the cell that can be visualized by the proper type of microscope. The type of promoter they are fused to just directs the tissue and/or developmental time of expression in the animal. Depending on the type of promoter used it may or may not need to be activated. For example heat-shock promoters need to have the animal heated above normal temp to induce expression. Other promoters are constitutive, so they are active all the time.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    February 3, 2014 - 3:14 PM
  6. Oh, I see. Thank you!

    How fast is the GFP produced? (for example, if I have GFP expression in DAergic neurons and do something to increase DAergic activity, can I see the increase in GFP right after, or how long will I have to wait?) Thanks.

    Reply
    Posted by: Marilyn Z.
    February 18, 2014 - 4:34 PM
  7. Again, how "fast" the GFP is produced depends on the type of transcriptional promoter it is attached to. The dat-1 promoter we use is expressed in the dopaminergic neurons. Once those cells have differentiated, the promoter is functional and the GFP is then expressed. So there is no need to activate these neurons to see the GFP. However, in other systems, a promoter may need to be activated (like the heat-shock example described above) to allow it to express the GFP.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    February 19, 2014 - 11:49 AM

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