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 JoVE Biology

तपेदिक के निदान के लिए MODs विधि और प्रतिरोधी तपेदिक बहुऔषध

1, 2, 3, 4

1The Warren Alpert Medical School of Brown University, 2Laboratorio de Investigacion de Enfermedades Infecciosas, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 3Department of International Health, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 4Wellcome Trust Centre for Clinical Tropical Medicine, Imperial College London

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    Summary

    सूक्ष्म अवलोकन - परख दवा संवेदनशीलता (Mods) एक कम लागत, कम तकनीक तपेदिक के उच्च प्रदर्शन का पता लगाने (टीबी) और बहुऔषध प्रतिरोधी तपेदिक (MDRTB) के लिए उपकरण है. यह वीडियो MODs तरल मीडिया संस्कृति विधि का वर्णन करता है.

    Date Published: 8/11/2008, Issue 18; doi: 10.3791/845

    Cite this Article

    Brady, M. F., Coronel, J., Gilman, R. H., Moore, D. A. The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis. J. Vis. Exp. (18), e845, doi:10.3791/845 (2008).

    Abstract

    सक्रिय फुफ्फुसीय तपेदिक (टीबी) के साथ मरीजों को प्रति वर्ष 10-15 अन्य व्यक्तियों को संक्रमित, दोनों रोगी के इलाज और नए संक्रमण को रोकने के लिए आवश्यक सक्रिय टीबी निदान बना. इसके अलावा, प्रतिरोधी तपेदिक (MDRTB) बहुऔषध के उद्भव का मतलब है कि दवा प्रतिरोध का पता लगाने के दवा प्रतिरोधी उपभेदों के प्रसार को रोकने के लिए आवश्यक है कि. सूक्ष्म अवलोकन - परख दवा संवेदनशीलता (Mods) एक कम लागत, कम तकनीक टीबी और MDRTB के उच्च प्रदर्शन का पता लगाने के लिए उपकरण है. Mods परख तीन सिद्धांतों पर आधारित है: 1) माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग (एमटीबी) ठोस 2 मीडिया पर से तरल मीडिया में तेजी से) बढ़ता सूक्ष्म एमटीबी विकास ठोस मीडिया पर कालोनियों की macroscopic उपस्थिति के लिए प्रतीक्षा की तुलना में तरल मीडिया में पहले पता लगाया जा सकता है, और वृद्धि की है कि एमटीबी की विशेषता है, अनुमति atypical माइक्रोबैक्टीरिया या कवक या बैक्टीरिया संदूषण 3) से प्रतिष्ठित MDRTB के साथ - साथ प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए अनुमति देने के isoniazid और रिफैम्पिसिन दवाओं Mods परख में शामिल किया जा सकता है है, subculture प्रदर्शन करने के लिए की जरूरत है obviating एक अप्रत्यक्ष दवा संवेदनशीलता परीक्षण. प्रतिस्पर्धा वर्तमान निदान थूक धब्बा कम संवेदनशीलता के साथ, ठोस मीडिया, संस्कृति मौजूदा तरल मीडिया संस्कृति तरीकों के साथ बेहद उच्च लागत, और अप्रत्यक्ष दवा संवेदनशीलता MDRTB का पता लगाने के परीक्षण के लिए उपसंस्कृति करने की जरूरत के साथ निदान जब तक लंबी देरी के द्वारा बाधा उत्पन्न कर रहे हैं. इसके विपरीत, गैर मालिकाना MODs विधि टीबी और MDRTB के लिए एक उच्च संवेदनशीलता है, एक अपेक्षाकृत तेजी संस्कृति विधि है, MDRTB के लिए एक साथ दवा संवेदनशीलता परीक्षण प्रदान करता है, और टीबी के लिए परीक्षण के लिए बस के नीचे $ 3 पर सीमित संसाधनों वाली स्थितियों के लिए सुलभ है और MDRTB.

    Protocol

    1. शेयर समाधान तैयार
      1. फास्फेट बफर स्टॉक
        1. पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार का समाधान (पोटेशियम फॉस्फेट 1000ml आसुत पानी में भंग तनहा नींव का 9.07g) 950ml और हलचल के साथ सोडियम dibasic समाधान की 950ml (सोडियम फॉस्फेट 1000ml आसुत पानी में भंग dibasic के 9.47g) मिक्स, प्रत्येक समाधान के 50ml वापस रखने को समायोजित करने के यदि आवश्यक पीएच
        2. 6.8 ± 0.2 पीएच समायोजित करें: ऐड सोडियम फॉस्फेट dibasic समाधान के पीएच बढ़ाने, कम पीएच पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार का समाधान जोड़ने
        3. 121-124 पर आटोक्लेव डिग्री सेल्सियस बाँझ बनाना करने के लिए 15 मिनट के लिए
        4. प्लेट 48 घंटे के लिए एक 37 फॉस्फेट एक पेट्री डिश और सेते में पोषक तत्व अगर मध्यम पर बफर समाधान ° सी के 100μl विभाज्य का बाँझपन की पुष्टि करने के लिए
        5. रेफ्रिजरेटर में 2-8 स्टोर ° C एक महीने तक के लिए

          नोट: प्रत्येक थूक नमूना फॉस्फेट समाधान बफर के 10ml की आवश्यकता
      2. परिशोधन शेयर
        1. सोडियम हीड्राकसीड समाधान के बराबर मात्रा में (200ml बाँझ आसुत पानी में भंग सोडियम हीड्राकसीड के 8.0g) और सोडियम साइट्रेट समाधान (200ml बाँझ आसुत पानी में आसुत सोडियम साइट्रेट की 5.8g) का मिश्रण
        2. मिक्स और 15 मिनट के लिए 121-124 ° सी में आटोक्लेव
        3. रेफ्रिजरेटर में 2-8 स्टोर ° C एक महीने तक के लिए

          नोट: प्रत्येक थूक के नमूने परिशोधन शेयर की 2ml की आवश्यकता
      3. संस्कृति मीडिया स्टॉक
        1. 900ml बाँझ आसुत जल के रूप में ग्लिसरॉल और casitone और 7H9 मध्यम पाउडर के 5.9g के 1.25g 3.1ml जोड़ने, लगातार आंदोलन के साथ मिश्रण जब तक पूरी तरह भंग
        2. 121-124 ° सी में 15 मिनट के लिए आटोक्लेव
        3. कूल और एंटीबायोटिक समाधान और आंतरिक नियंत्रण की तैयारी के लिए नमूना तैयार करने के लिए बाँझ 16x 100 मिमी ग्लास ट्यूब, और 10.8ml aliquots में 4.5ml aliquots में बाँझ माध्यम विभाजित
        4. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस 48 घंटे के लिए बाँझपन (turbidity की कमी) को सत्यापित करने के लिए
        5. 2-8 ° सी टोपी के साथ स्टोर कसकर एक महीने के लिए बंद करने के लिए

          नोट: प्रत्येक थूक नमूना एक ट्यूब 7H9 मध्यम युक्त 4.5ml की आवश्यकता
      4. एंटीबायोटिक शेयर समाधान
        1. ए Isoniazid शेयर (8 मिलीग्राम / एमएल)
          1. भंग 20 मिलीग्राम 2.5ml बाँझ आसुत पानी में पूरी तरह से isoniazid
          2. जलीय विलायक के लिए फ़िल्टर 0.2μm सिरिंज फिल्टर के साथ
          3. -20 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ सूक्ष्म centrifugation ट्यूब में 20μl aliquots में 6 महीने के लिए स्टोर

            नोट: प्रत्येक संग्रहीत 20μl विभाज्य 100 नमूने (अपव्यय सहित) के लिए पर्याप्त है
        2. बी रिफैम्पिसिन शेयर (8 मिलीग्राम / एमएल)
        1. 1.25ml DMSO में 20mg रिफैम्पिसिन पूरी तरह से भंग
        2. 1.25ml बाँझ आसुत पानी और मिश्रण जोड़ें
        3. कार्बनिक विलायक के लिए फ़िल्टर 0.2μm सिरिंज फिल्टर के साथ
        4. -20 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ microcentrifuge ट्यूबों में 20μl aliquots में 6 महीने के लिए स्टोर

          नोट: प्रत्येक संग्रहीत 20μl विभाज्य 100 नमूने (अपव्यय सहित) के लिए पर्याप्त है
    2. काम कर रहे समाधान तैयार
      1. परिशोधन काम कर समाधान
        1. परिशोधन आवश्यक समाधान के हर 20ml में NALC क्रिस्टल के 0.1g भंग

          नोट: प्रत्येक नमूना परिशोधन समाधान के 2ml की जरूरत

          नोट: किसी भी परिशोधन NaOH NALC समाधान है कि 24 घंटे के बाद अप्रयुक्त रहता रूप NALC समय पर अपनी mucolytic गतिविधि खो देता है त्यागें
      2. संस्कृति समाधान काम कर मीडिया
        1. बाहर सेट:
          1. हर थूक के नमूने के लिए 7H9 मध्यम के साथ एक ट्यूब संसाधित किया जा करने के लिए, प्लस 1 हर प्लेट के लिए अतिरिक्त ट्यूब (नकारात्मक नियंत्रण स्तंभ के लिए)
          2. सकारात्मक नियंत्रण के लिए 7H9 माध्यम से 2 ट्यूबों (3 अगर monoresistant उपभेदों इस्तेमाल किया जाता है)
          3. एंटीबायोटिक समाधान तैयार करने के लिए 10.8ml 7H9 के साथ 1-2 ट्यूबों
        2. 0.5ml OADC 7H9 के 4.5ml प्रत्येक नमूना ट्यूब में जोड़ें
        3. ट्यूबों 7H9 10.8ml साथ 1.2ml OADC जोड़ें
        4. एक तरफ सकारात्मक नियंत्रण के लिए 5ml 7H9 OADC, और ट्यूब 12ml 7H9 OADC एंटीबायोटिक समाधान तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा (इन PANTA की आवश्यकता नहीं है) के साथ (ओं) के साथ 2 ट्यूब सेट
        5. Reconstitute PANTA और प्रत्येक नमूना ट्यूब और नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब (7H9 OADC - PANTA: कुल 5.1ml = मात्रा) 0.1ml जोड़ने

          नोट: PANTA (7H9 OADC - PANTA) के साथ पूरा मध्यम थूक के नमूने और नकारात्मक नियंत्रण के लिए प्रयोग किया जाता है, PANTA बिना 7H9 OADC सकारात्मक नियंत्रण के लिए और एंटीबायोटिक समाधान तैयार करने के लिए उपयोग
      3. एंटीबायोटिक काम कर समाधान
        1. 1. एक अप्रयुक्त 24 अच्छी तरह से थाली में एंटीबायोटिक काम कर समाधान बनाने के चरणों के लिए चित्र 1 देखें

          नोट: सही संवेदनशीलता परिणामों के लिए, अंतिम एंटीबायोटिक सांद्रता महत्वपूर्ण हैं. निम्न कार्यविधि एल के लिए उपयुक्त हैaboratories micropipettes के साथ सुसज्जित है. यदि micropipettes उपलब्ध नहीं हैं, ट्यूबरकुलीन सीरिंज उपयोगकर्ता गाइड परिशिष्ट 3 में वर्णित modsperu.org पर dilutions की एक अलग श्रृंखला के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है

          नोट: प्रसंस्करण दिन चित्रा 1 के अंत में सभी अप्रयुक्त एंटीबायोटिक समाधान त्यागें फिर फ्रीज या एंटीबायोटिक काम या शेयर समाधान फिर से उपयोग के रूप में दवा गतिविधि खो दिया जा सकता है नहीं. एंटीबायोटिक का काम कर रहे समाधान बनाना (modsperu.org उपयोगकर्ता के गाइड से)
    3. थूक नमूना और तैयारी की थाली
      1. शुद्धीकरण
        1. थूक के नमूने के एक 15ml अपकेंद्रित्र ट्यूब में प्लेस 2ml (अगर कम है, 2ml के लिए फॉस्फेट बफर के साथ, अगर और अधिक, 2ml केवल उपयोग)
        2. 2ml समाधान NaOH - NALC जोड़ें
        3. कैप कसकर ट्यूब और 20 सेकंड के लिए भंवर, ट्यूब पलटना NaOH - NALC समाधान संपर्कों ट्यूब के पूरे आंतरिक सतह और ढक्कन सुनिश्चित
        4. 15 मिनट की एक न्यूनतम के लिए खड़े चलो कुछ ही मिनटों के द्वारा लम्बा अगर नमूना विशेष रूप से चिपचिपा है. इलाज पर से बचने के लिए, 20 मिनट से अधिक नहीं होनी चाहिए
        5. 14ml फॉस्फेट बफर (6.8 पीएच) के साथ ट्यूब क्षार बेअसर और परिशोधन प्रक्रिया को समाप्त करने के लिए, और मिश्रण अच्छी तरह से inverting ट्यूब द्वारा 4 बार भरें
        6. जी 3000 में 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र (उपयोगकर्ता के गाइड में परिशिष्ट 2 जी 3000 तक पहुँचने के लिए आवश्यक प्रति मिनट rotations के समीकरण के लिए modsperu.org पर देख)
        7. ध्यान से बंद 10% सोडियम hypochlorite या अन्य उपयुक्त निस्संक्रामक के साथ एक तरल अपशिष्ट कंटेनर में सतह पर तैरनेवाला और डाल गोली बनाए रखने
      2. अंतिम नमूना निलंबन और बैकअप की तैयारी
        1. (5.1ml युक्त ट्यूब से) 7H9 OADC - PANTA, का उपयोग एक पाश्चर विंदुक के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूब में 2ml की कुल मात्रा में नमूना गोली resuspend, मिश्रण अच्छी तरह से
        2. एक बैकअप के रूप में नमूना निलंबन और 2-8 में एक microcentrifuge ट्यूब में दुकान ° C के 1ml निकालें
        3. शेष 7H9 OADC - PANTA के साथ ट्यूब के लिए नमूना निलंबन की दूसरी 1ml जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से. यह अंतिम चढ़ाना के लिए नमूना तैयार समाधान है
      3. 24 अच्छी तरह से थाली में रखकर नमूना निलंबन
        1. अंतिम नमूना निलंबन के एक स्तंभ के कुओं की 24 अच्छी तरह से थाली में 4 प्रत्येक में प्लेस 900μl
        2. थाली के सभी स्तंभों जब तक अतिरिक्त नमूनों के साथ दोहराएँ, स्तंभ 3 के अलावा, कर रहे हैं भरा (या जब तक सभी नमूनों को चढ़ाया जाता है)
        3. 7H9 OADC मध्यम के प्रत्येक नमूना थाली के 3 स्तंभ की 4 कुओं (नकारात्मक आंतरिक नियंत्रण) में नमूना के बिना प्लेस 900μl
      4. नमूने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ना
        1. एक बहु चैनल विंदुक का प्रयोग, ध्यान 100μl साथ 7H9 OADC और एंटीबायोटिक काम कर रहे समाधान (एंटीबायोटिक कमजोर पड़ने में 2 कॉलम चित्रा 1 प्लेट देखें) के साथ कुओं से 4 युक्तियाँ को भरने
        2. स्तंभ 1 कुओं 900μl नमूना समाधान के साथ थाली या नमूना छू के बिना 100μl aliquots जोड़ें
        3. दोहराएँ जब तक सभी स्तंभों माध्यम की अतिरिक्त 100μl (कुओं दवा मुक्त) या (नकारात्मक नियंत्रण 3 स्तंभ सहित) एंटीबायोटिक समाधान प्राप्त किया है
        4. और एक sealable पॉलिथीन बैग (Ziplock) और मुहर में ढक्कन जगह के साथ थाली बंद (बैग फिर से इस बिंदु के बाद से खोला नहीं है)
        5. 37 डिग्री सेल्सियस (सीओ 2 संवर्धन के लिए आवश्यक नहीं है) पर सेते
    4. गुणवत्ता नियंत्रण
      1. नकारात्मक नियंत्रण प्रत्येक प्लेट पर चलाए जा रहे हैं किसी भी नकारात्मक नियंत्रण स्तंभ में कुओं की में किसी भी वृद्धि की उपस्थिति पार संदूषण, इसलिए पूरी थाली त्याग किया जाना चाहिए और फिर चढ़ाया नमूने इंगित करता है .
      2. सकारात्मक नियंत्रण एक अलग प्लेट पर दिन के अंत में चलाए जा रहे हैं पूरी तरह से एक दवा अतिसंवेदनशील तनाव एक स्तंभ और एक तनाव INH और राइफल्स के लिए प्रतिरोधी है अन्य स्तंभ में चलाने में चलाया जाता है.. अगर वहाँ एक एमडीआर तनाव चल रहा है के बारे में चिंता है, दोनों एक INH monoresistant तनाव और एक राइफल्स monoresistant तनाव अतिसंवेदनशील और एमडीआर उपभेदों के स्थान में चला जा सकता है. सभी सकारात्मक नियंत्रण दवा मुक्त कुओं में वृद्धि करने के लिए कि मीडिया का समर्थन वृद्धि का प्रदर्शन होना चाहिए. दिखाना है कि दवा सांद्रता सही हैं, अतिसंवेदनशील तनाव INH या राइफल्स कुओं में विकसित नहीं है, लेकिन एमडीआर तनाव INH राइफल्स और कुओं में भी वृद्धि हो जाना चाहिए चाहिए.
    5. प्लेट पढ़ने
      1. के रूप में चढ़ाना के दिन के साथ प्लेट पढ़ने "0 दिन, 5 दिवस के अवसर पर शुरू होता है, और अगर नकारात्मक दिवस के अवसर पर 5 पढ़ने हर दिन किया जाता है 14 दिन और फिर 15 दिन से हर 2-3 दिन तक (या वैकल्पिक दिन काम का बोझ पर निर्भर करता है) -21. प्लेट्स पर जांच कर रहे हैं10x उद्देश्य से औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप
      2. एक सकारात्मक संस्कृति जिसमें दोनों दवा मुक्त कुओं में दो या दो से अधिक कॉलोनी के गठन इकाइयों (> 2 CFU) है. प्रारंभिक माइक्रोबैक्टीरियल वृद्धि छोटे घुमावदार अल्पविराम या सर्पिल (5-9 दिन) की तरह दिखता है. कालोनी गठन आमतौर पर "डोरियों" या "tangles" (modsperu.org पर छवि लायब्रेरी देखते) की प्रगति
      3. दिन में एक संस्कृति 2 दवा मुक्त कुओं, दवा युक्त कुओं को पढ़ा जाना चाहिए में सकारात्मक एक दवा की उपस्थिति में कोई वृद्धि है कि दवा के लिए प्रतिरोध इंगित करता है .

        नोट: यदि दवा युक्त कुओं के पढ़ने> 1 सप्ताह के बाद एक सकारात्मक संस्कृति दवा मुक्त कुओं में उल्लेख किया है किया जाता है, इस विकास को तोड़ने के माध्यम के रूप में प्रतिरोध का प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है कभी कभी देखा जाता है
      4. नमूने है कि 21 दिन से सकारात्मक नहीं कर रहे हैं नकारात्मक संस्कृतियों माना जाता है
      5. कुओं की cloudiness संदूषण अतिवृद्धि का एक परिणाम है, जबकि माइक्रोबैक्टीरियल विकास cloudiness में परिणाम नहीं करता
      6. 21 दिनों के पूरा होने पर संस्कृतियों का त्याग हो सकता है. संस्कृतियों उनके सील बैग में रहते हैं और आटोक्लेव बैग में रखा और 45-60 मिनट के लिए 121-124 ° सी में autoclaved

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    Discussion

    Mods परख सीमित संसाधनों वाली स्थितियों पर लक्षित है. पहली बार के लिए, Mods तपेदिक के तेजी से तरल संस्कृति का पता लगाने के लिए क्षमता लाता है और सीमित संसाधनों वाली स्थितियों के लिए बस के नीचे $ 3 परीक्षण प्रति प्रतिरोधी तपेदिक बहुऔषध. Mods एक गैर मालिकाना पद्धति चलने का है, और Mods समुदाय हमेशा सुधार में रुचि है कि अन्य प्रयोगशालाओं बनाने में कामयाब रहे हैं.

    एक आवर्तक चिंता तपेदिक के तरल मीडिया संस्कृति की जैव सुरक्षा है क्योंकि तरल पदार्थ या गिरा दिया जा सकता है aerosolized. हम विश्वास है कि Mods परख किसी भी है कि इसमें शामिल अप्रत्यक्ष दवा संवेदनशीलता परीक्षण परख की तुलना में अधिक BIOSAFE है क्योंकि अप्रत्यक्ष दवा संवेदनशीलता परीक्षण spillage और aerosolization के परिचर जोखिम के साथ माइक्रोबैक्टीरिया के अत्यधिक ध्यान केंद्रित समाधान के हेरफेर शामिल है, इसके विपरीत में, Mods बस का टीका शामिल एक थाली में थूक नमूना, जिसके बाद थाली एक प्लास्टिक बैग के भीतर बंद है और फिर कभी नहीं खोला. यह कोरिया (2007 किम) से पता चला है जो कि व्यावसायिक जोखिम प्रयोगशाला श्रमिकों जो बाहर दवा संवेदनशीलता परीक्षण कर बिना थूक के नमूने मढ़वाया थूक स्मियर माइक्रोस्कोपी कर कार्यकर्ताओं में से अधिक नहीं था से डेटा द्वारा समर्थित है, इसके विपरीत में, उन कर दवा संवेदनशीलता परीक्षण बहुत अधिक तपेदिक के लिए व्यावसायिक जोखिम था.

    हम दृढ़ता से अनुशंसा करते हैं कि इन प्रक्रियाओं में से कोई भी प्रयोगशाला श्रमिकों के लिए उचित सावधानियों के बिना किया जाना है. यह व्यक्तिगत श्वसन संरक्षण, एक कक्षा 2 थक HEPA फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड हवा के साथ जैविक सुरक्षा कैबिनेट, और प्रयोगशाला के दरवाजे पर ताला airflow की अशांति को रोकने जबकि नमूने चालाकी से किया जा रहा है के लिए N-95 मास्क भी शामिल है.

    Extrapulmonary नमूने के प्रसंस्करण के लिए मानक संचालन प्रक्रियाओं, माइकोबैक्टीरियम tubercuclosis और अन्य माइक्रोबैक्टीरिया और बैक्टीरियल और फंगल संदूषण की एक तस्वीर पुस्तकालय, एक सिफारिश की गुणवत्ता आश्वासन रणनीति, MODs का उपयोग शुरू करने के लिए प्रयोगशालाओं की मान्यता के लिए एक प्रक्रिया है, और एक अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न शीट modsperu.org पर उपलब्ध हैं

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    Disclosures

    Acknowledgements

    हम तपेदिक विकास वीडियो समय चूक खंड के लिए शॉन Fitzwater और कारमेन Giannina लूना कोलंबो स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं. हम उसे पूरी तरह से और उत्कृष्ट प्रतिक्रिया के लिए संपादन के दौरान मार्टी नट और सह संलेखन उपयोगकर्ता के गाइड है, जिसमें से वर्तमान प्रोटोकॉल ज्यादातर शब्दशः लिया गया था धन्यवाद. इस वीडियो का उत्पादन NIH / Fogarty इंटरनेशनल सेंटर द्वारा वित्त पोषित किया गया था http://www.fic.nih.gov/ डेविड ए जे मूर इंपीरियल कॉलेज लंदन में संक्रामक रोगों में वेलकम ट्रस्ट क्लीनिकल ट्रॉपिकल मेडिसिन और रीडर में रिसर्च फैलो (फैलोशिप के रूप में योगदान दिया पुरस्कार 078067/Z/05 संख्या). मार्क एफ ब्रैडी एक NIH / Fogarty इंटरनेशनल सेंटर रिसर्च फैलो के रूप में योगदान दिया.

    Materials

    Name Type Company Catalog Number Comments
    Refrigerator/ freezer Equipment to store pre-prepared broth and antibiotic stocks
    Vortex Equipment to aid sputum decontamination
    Centrifuge Equipment for sputum concentration; capable of reaching 3000 g; d–s not need to be refrigerated, but MUST be biosafe (buckets can be sealed)
    Incubator (37 degree C) Equipment for culture; need not be CO2 enriched
    Inverted light microscope Microscope to read MODS plates
    Autoclave Equipment to sterilize media, PBS and used plates
    Balance Equipment to weigh isoniazid, rifampicin and NALC
    Middlebrook 7H9 broth (Difco) Reagent Fisher Scientific DF0713-17-9 500gr/bottle; culture media base
    Casitone (pancreatic digest casein) Reagent Fisher Scientific DF0259‐17‐9 500gr/bottle; culture media base
    Glycerol (glycerin) lyophilized Reagent Sigma-Aldrich G‐33‐500 500ml/bottle; culture media base
    PANTA (Antibiotic mixture lyophilized BD) Reagent Fisher Scientific B4345114 6 bottles/pack; antibiotic media supplement
    OADC (Middlebrook OADC enrichment BD) Reagent Fisher Scientific B11886 10 x 20ml/pack; nutritional media supplement
    Dimethyl sulphoxide (Hibri-Max) Reagent Sigma-Aldrich D-2650 100ml/bottle; to prepare rifampicin stock
    Antibiotic stocks: isoniazid Reagent Sigma-Aldrich I-3377 50gr/bottle; direct susceptibility testing
    Antibiotic stocks: rifampicin Reagent Sigma-Aldrich R-3501 1gr/bottle; direct susceptibility testing
    Sodium hydroxide (pellets) Reagent Sigma-Aldrich 221465 500gr/bottle; sputum decontamination
    Sodium citrate (trisodium salt dihydrate) Reagent Sigma-Aldrich S-4641 500gr/bottle; sputum decontamination
    N-acetyl-L-cysteine Reagent Sigma-Aldrich A-7250 50gr/bottle; sputum decontamination
    Potassium Phosphate Monobasic crystal. KH2PO4 Reagent Sigma-Aldrich P0662 500gr/bottle; sputum decontamination
    Sodium Phosphate Dibasic, anhydrous. Na2HPO4 Reagent Sigma-Aldrich S0876 500gr/bottle; sputum decontamination
    Sodium hypochlorite Reagent household bleach to discard contaminated waste
    15ml centrifuge tubes (polypropylene 15ml Falcon 35‐2096) Consumable Fisher Scientific 14‐959‐49B 500ea/case; for sputum decontamination and concentration
    24 well plates (Plates Tissue 24 wells BD Falcon 35‐3047) Consumable Fisher Scientific 08-772-1 50 plates/case; for culture and reading
    Sealable polythene bags 6 X 6 “ (ziplock) Consumable for biosecurity to contain 24 well plate
    Glass tubes with lid (16 x 100mm and 18 x 145mm) Consumable VWR international 47729-583 500 tubes/case; to store aliquots of prepared broth
    Screw cap microcentrifuge tubes (1.5ml) Consumable Fisher Scientific 05‐669‐22 1000ea/case; to store aliquots of antibiotic stocks
    0.22μm filters (aqueous solvents) Syringe filter Millex blue Consumable Fisher Scientific SLGL 025 OS 50 units/case; to filter antibiotic stocks
    0.22μm filters (organic solvents) Syringe filter Millex yellow Consumable Fisher Scientific SLGV 033 RS 50 units/case; to filter antibiotic stocks
    Disposable Pasteur pipettes borosilicate glass 9″ Consumable Fisher Scientific 13‐678‐20C 720ea/case; to mix PANTA with media mix
    Aerosol barrier tips 1000‐1300μl Consumable Fisher Scientific 02‐707‐51 1000ea/pk; to dispense media into plate
    USA Scientific Tips One 1‐200μl yellow tips Consumable Fisher Scientific 1111‐0006 1000 tips/bag; to dilute antibiotic stocks

    References

    1. Arias, M. Clinical evaluation of the microscopic-observation drug-susceptibility assay for detection of tuberculosis. Clin Infect Dis. 44, 674-674 (2007).
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    4 Comments

    I think it is an interesting video about the rapid diagnosis of tuberculosis by MODS assay but I also think this assay might be improve if the casein is replaced by simple amino acids in order to generate a chemically culture medium.
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 10, 2009, 11:21 AM

    nice work.  how dŒs this compare to the MABA method?  what is the false positive and false negative rates with samples from adult humans?
    Reply

    Posted by: AnonymousMarch 9, 2009, 9:47 AM

    very good site for TB, but method lacks the video of reading a plate on inverted microscope.
    Reply

    Posted by: AnonymousMarch 31, 2009, 3:38 PM

    Excelente trabajo, el MODS es una tecnica infalible, considero que existe buena concordancia con las pruebas confirmatorias de sensibilidad a drogas como metodo proporciones, APP, TEMA, MABA e incluso Fagotipificacion.
    Reply

    Posted by: cesar augusto r.November 3, 2009, 11:17 PM

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