ЭС клетки человека: начиная культуры из замороженных клеток

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Здесь показано, как в нашей лаборатории начинается оттенки человеческих эмбриональных стволовых клеточной линии культуры из замороженного запаса.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells. J. Vis. Exp. (1), e86, doi:10.3791/86 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Здесь показано, как в нашей лаборатории начинается оттенки человеческих эмбриональных стволовых клеточной линии культуры из замороженного запаса. Во-первых, 1:59 дневных десять см пластины приблизительно один (два) миллиона облученных мышиных эмбриональных фибробластов фидерные клетки промывают оттенков СМИ, чтобы удалить остатки сыворотки и сотовых мусора, а затем добавил оттенки СМИ и оставил, чтобы уравновесить в клетке культуры инкубатора. Замороженный флакон клеток от долгосрочного хранения в жидком азоте или-80C морозильник был добыт и быстро погружается в ванну воды 37С для быстрого оттаивания. Ячейки в замораживании средств массовой информации удаляют из флакона и помещен в большом объеме оттенков СМИ. Большой объем оттенков СМИ облегчает удаление лишней сыворотки и ДМСО, который может вызвать оттенки человеческих эмбриональных стволовых клеток дифференцироваться. Клетки осторожно вышла из-под подвеску, а затем вновь приостановлено в небольшом объеме свежих СМИ оттенков, которые затем используются для семян MEF пластины. Это считается важным для семян MEF пластину, осторожно добавить оттенки клетки в капле мудрый модой чтобы равномерно рассредоточить их по всему пластины. Вновь созданных оттенков культуры пластина возвращается в инкубаторе в течение 48 часов до средств массовой информации заменяется, а затем подается каждые 24 часа после этого.

Protocol

Оттепель из замороженных складе:

  1. Перед оттаиванием оттенков клетки, убедитесь, что пластины MEF вы уже подготовили должным образом покрытие в хорошем состоянии. НЕ пытайтесь использовать меньше, чем желательно пластинку, или тот, который старше, чем три дня. Рекомендуется предварительно маркировать все конических труб и колодцев используется.

  2. Предварительно теплых оттенков средствах массовой информации до 37 ° C. Алиготе оттенков СМИ в стерильные конические трубки для каждой линии. Удалить оттенков флакон / с от -80 и сразу же погрузить нижнюю часть трубки в 37 ° С водяной бане. Это должно занять около 45-60 секунд, прежде чем клетки 80% талой (малая часть замороженных слева).

  3. Быстро довести трубку ламинарном боксе, спрей вниз с 70% спиртом и аккуратно переводить клетки предварительно нагревается СМИ. Спиновые трубку, удалить средства массовой информации, и ресуспендируют в соответствующий объем свежей, подогретого оттенков СМИ.

  4. Аспирацию с MEF средств массовой информации из многих скважин, как вы будете оттаивания в. Быстро, аликвоту подогретого оттенков СМИ обратно в каждую лунку пластины, стараясь не мешать прилагается MEFs. Установите пластину в сторону в капюшон. Как и MEFs, лучшие результаты получаются, если капли равномерно распределены по тарелке. Осторожно вернуть пластину 37 ° С инкубатор ночь, чтобы оттенки клетки семенных MEFs. Изменение среды ~ 48 часов после оттепели, заменяя со свежими СМИ оттенков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом видеоролике мы покажем, как наша лаборатория регулярно устанавливает оттенки человеческих стволовых эмбриональных клеточных культур из замороженного запаса. Этот процесс поддается для общего использования с любыми клетка млекопитающего, если замороженные в растворе ДМСО. Эффективное оттаивания имеет важное значение для создания новой культуры оттенков клетки из замороженного запаса, и имеет важное значение для экспериментальной консистенции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 ml Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng/ml final) 0.65 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cowan, C. A. Derivation of Embryonic Stem Cells from Human Blastocysts. 1650-1656 (2004).

Comments

2 Comments

  1. ل²7;ع²A; ²7;²C;²8;و²F;ن²7; :)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 23, 2008 - 2:04 AM
  2. ²7;ي و²7;لله ص²D; كل²7;مك

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 5, 2009 - 1:43 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics