ЭС клетки человека: начиная культуры из замороженных клеток

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь показано, как в нашей лаборатории начинается оттенки человеческих эмбриональных стволовых клеточной линии культуры из замороженного запаса.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells. J. Vis. Exp. (1), e86, doi:10.3791/86 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Здесь показано, как в нашей лаборатории начинается оттенки человеческих эмбриональных стволовых клеточной линии культуры из замороженного запаса. Во-первых, 1:59 дневных десять см пластины приблизительно один (два) миллиона облученных мышиных эмбриональных фибробластов фидерные клетки промывают оттенков СМИ, чтобы удалить остатки сыворотки и сотовых мусора, а затем добавил оттенки СМИ и оставил, чтобы уравновесить в клетке культуры инкубатора. Замороженный флакон клеток от долгосрочного хранения в жидком азоте или-80C морозильник был добыт и быстро погружается в ванну воды 37С для быстрого оттаивания. Ячейки в замораживании средств массовой информации удаляют из флакона и помещен в большом объеме оттенков СМИ. Большой объем оттенков СМИ облегчает удаление лишней сыворотки и ДМСО, который может вызвать оттенки человеческих эмбриональных стволовых клеток дифференцироваться. Клетки осторожно вышла из-под подвеску, а затем вновь приостановлено в небольшом объеме свежих СМИ оттенков, которые затем используются для семян MEF пластины. Это считается важным для семян MEF пластину, осторожно добавить оттенки клетки в капле мудрый модой чтобы равномерно рассредоточить их по всему пластины. Вновь созданных оттенков культуры пластина возвращается в инкубаторе в течение 48 часов до средств массовой информации заменяется, а затем подается каждые 24 часа после этого.

Protocol

Оттепель из замороженных складе:

  1. Перед оттаиванием оттенков клетки, убедитесь, что пластины MEF вы уже подготовили должным образом покрытие в хорошем состоянии. НЕ пытайтесь использовать меньше, чем желательно пластинку, или тот, который старше, чем три дня. Рекомендуется предварительно маркировать все конических труб и колодцев используется.

  2. Предварительно теплых оттенков средствах массовой информации до 37 ° C. Алиготе оттенков СМИ в стерильные конические трубки для каждой линии. Удалить оттенков флакон / с от -80 и сразу же погрузить нижнюю часть трубки в 37 ° С водяной бане. Это должно занять около 45-60 секунд, прежде чем клетки 80% талой (малая часть замороженных слева).

  3. Быстро довести трубку ламинарном боксе, спрей вниз с 70% спиртом и аккуратно переводить клетки предварительно нагревается СМИ. Спиновые трубку, удалить средства массовой информации, и ресуспендируют в соответствующий объем свежей, подогретого оттенков СМИ.

  4. Аспирацию с MEF средств массовой информации из многих скважин, как вы будете оттаивания в. Быстро, аликвоту подогретого оттенков СМИ обратно в каждую лунку пластины, стараясь не мешать прилагается MEFs. Установите пластину в сторону в капюшон. Как и MEFs, лучшие результаты получаются, если капли равномерно распределены по тарелке. Осторожно вернуть пластину 37 ° С инкубатор ночь, чтобы оттенки клетки семенных MEFs. Изменение среды ~ 48 часов после оттепели, заменяя со свежими СМИ оттенков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом видеоролике мы покажем, как наша лаборатория регулярно устанавливает оттенки человеческих стволовых эмбриональных клеточных культур из замороженного запаса. Этот процесс поддается для общего использования с любыми клетка млекопитающего, если замороженные в растворе ДМСО. Эффективное оттаивания имеет важное значение для создания новой культуры оттенков клетки из замороженного запаса, и имеет важное значение для экспериментальной консистенции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 ml Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng/ml final) 0.65 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cowan, C. A. Derivation of Embryonic Stem Cells from Human Blastocysts. 1650-1656 (2004).

Comments

2 Comments

  1. ل²7;ع²A; ²7;²C;²8;و²F;ن²7; :)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 23, 2008 - 2:04 AM
  2. ²7;ي و²7;لله ص²D; كل²7;مك

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 5, 2009 - 1:43 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics