Mänskliga ES-celler: Starta Kultur från frusna celler

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Här kan vi visa hur vårt labb börjar en nyanser stamceller från mänskliga embryon kulturen cellinje från en frusen lager.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells. J. Vis. Exp. (1), e86, doi:10.3791/86 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Här kan vi visa hur vårt labb börjar en nyanser stamceller från mänskliga embryon kulturen cellinje från en frusen lager. För det första är ett till två dygn gamla tio cm tallrik med cirka en (eller två) miljoner bestrålade möss embryonala fibroblast feeder celler sköljas med nyanser media för att avlägsna rester av serum och cellfragment och sedan nyanser media tillkommit och vänster till jämvikt i cellen kultur inkubator. En frusen injektionsflaska med celler från långsiktig flytande kväve lagring eller en-80C frys anskaffas och snabbt nedsänkt i en 37C vattenbad för snabb upptining. Celler i frysning media sedan bort från flaskan och placeras i en stor mängd nyanser medier. Den stora volymen av nyanser medier underlättar borttagning av överskott serum och DMSO, vilket kan orsaka nyanser mänskliga embryonala stamceller att differentiera. Celler är försiktigt spunna ur sin vila, och sedan suspenderas i en liten volym av färska nyanser media som sedan används till utsäde MEF plattan. Det anses viktigt att utsädet MEF plattan genom att försiktigt lägga till nyanser celler i ett droppvis sätt för att jämnt sprida ut dem över hela plattan. Det nybildade nyanser odlingsplatta återförs till inkubator för 48 timmar före media ersätts, matas sedan varje 24 timmar därefter.

Protocol

Tina från en frusen lager:

  1. Före upptining nyanser celler, se till att MEF plattan du redan har förberett ordentligt klädd och i gott skick. Försök INTE att använda en mindre än önskvärt platta, eller en som är äldre än tre dagar. Det rekommenderas att i förväg märka alla koniska rör och brunnar som används.

  2. Pre-varma nyanser media till 37 ° C. Alikvotera nyanser media i en steril koniska rör för varje rad. Ta bort nyanser flaska / s från -80 och omedelbart dränka den nedre halvan av röret i 37 ° C vattenbad. Det bör ta ca 45-60 sekunder innan cellerna är 80% tinat (små frysta delen till vänster).

  3. Snabbt föra röret till laminär strömning huven, spraya ner med 70% alkohol, och försiktigt överföra celler till i förvärmda media. Spin röret, ta bort media och återsuspendera i en lämplig volym av färska, förvärmda nyanser media.

  4. Sug bort MEF media från så många brunnar som du kommer att tina upp till. Snabbt, alikvot förvärmda nyanser media tillbaka i varje brunn i plattan, var noga med att inte störa den bifogade MEFs. Ställ plåten åt sidan i huven. Som med MEFs, bäst resultat fås om dropparna är jämnt fördelade över plattan. Försiktigt tillbaka plattan till ett 37 ° C inkubator över natten så att nyanser cellerna till utsäde i MEFs. Ändra media ~ 48 timmar efter upptining, ersätta med nya nyanser medier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna video visar vi hur vårt laboratorium rutinmässigt fastställer en nyanser mänskliga embryonala kultur stamcell från ett fruset lager. Denna process är mottaglig för allmänt bruk med alla däggdjursceller om de är frysta i ett DMSO lösning. Effektiv tina är avgörande för att skapa en ny kultur av nyanser celler från en frusen lager, och är viktig för experimentell konsekvens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 ml Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng/ml final) 0.65 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cowan, C. A. Derivation of Embryonic Stem Cells from Human Blastocysts. 1650-1656 (2004).

Comments

2 Comments

  1. ل²7;ع²A; ²7;²C;²8;و²F;ن²7; :)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 23, 2008 - 2:04 AM
  2. ²7;ي و²7;لله ص²D; كل²7;مك

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 5, 2009 - 1:43 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics